Univerzální heparinové antidotum se zanedbatelným účinkem na fibrin(ogen) a plazmatickou koagulaci

Východiska a cíl

Antikoagulancia hrají klíčovou roli v léčbě tromboembolických poruch. Krvácení u chirurgických pacientů užívajících antikoagulancia představuje závažný problém. Proti antikoagulaci a k obnovení normální hemostázy se podávají antidota. Dosud je jediným klinicky schváleným antidotem nefrakcionovaného heparinu kationický polypeptid protamin sulfát (PS). PS má toxické vedlejší účinky a omezení. Neschopnost PS zcela zvrátit nízkomolekulární hepariny a fondaparinux je způsobena jeho nízkou vazebnou afinitou k těmto léčivům. PS však interaguje s koagulačními proteiny, jako je fibrinogen, a vytváří agregáty, což vede ke kardiovaskulárním nežádoucím účinkům. Nedávno jsme vyvinuli syntetické univerzální heparinové reverzní činidlo (UHRA) s vysokou vazebnou afinitou k heparinům. Studie in vivo ukázaly, že UHRA zcela reverzuje aktivitu všech klinicky dostupných parenterálních antikoagulancií a je netoxický. Cílem této studie je prokázat netoxičnost UHRA posouzením jeho vlivu na fibrinogen, architekturu fibrinové sraženiny, srážení plazmy a lýzu sraženiny.

Metody

UHRA byl vyvinut začleněním vazebných skupin pro heparin na bázi terciárních aminů na dendritický hyperrozvětvený polyglycerolový scaffold a jeho obalením methoxy polyethylenglykolovými řetězci. Pro pochopení vlivu UHRA na koagulační systém byly provedeny rekalcifikační a turbidimetrické testy srážení plazmy iniciované tkáňovým faktorem (TF). Interakce UHRA na fibrinogen byla zkoumána pomocí testu agregace fibrinogenu, testu polymerace fibrinu a spektroskopické analýzy (fluorescence a cirkulární dichroismus (CD)). Vliv UHRA na architekturu fibrinové sraženiny byl hodnocen pomocí skenovací elektronové mikroskopie (SEM). antikoagulační neutralizace (heparinů) UHRA byla studována pomocí fluorogenního testu generace trombinu (TGA) v lidské plazmě bohaté na destičky (PRP). Lýza TF indukované plazmatické sraženiny obsahující UHRA nebo PS vystavené exogennímu tkáňovému aktivátoru plazminogenu (t-PA) byla studována turbidimetrickým testem.

Výsledky a diskuse

Výsledky testů srážení plazmy ukázaly, že UHRA nezměnila parametry srážení v porovnání s PS (doba zpoždění iniciovaná TF a maximální absorbance, kontrola vs UHRA 200 mcg/ml, p=0.21 a 0,16; doba zpoždění a maximální absorbance při rekalcifikaci, kontrola vs UHRA 200 mcg/ml, p=0,08 a 0,13, v uvedeném pořadí), což naznačuje, že UHRA nemá při studované koncentraci žádný vliv na koagulační systém (obrázek 1). Na rozdíl od protaminu nebyl test agregace fibrinogenu a polymerace fibrinu ovlivněn UHRA v širokém rozmezí koncentrací od 0,05 mg/ml do 1 mg/ml. Spolu s měřením zhášení fluorescence tryptofanu (obr. 2) a měřením sekundární struktury fibrinogenu potvrzuje, že UHRA s fibrinogenem neinteraguje. Výsledky jsou zcela odlišné od PS a dalších syntetických kationtových polymerů, které interagují s fibrinogenem a vyvolávají agregaci a konformační změny. Fibrinové sraženiny vytvořené v přítomnosti UHRA (i v koncentraci 0,5 mg/ml) vykazovaly podobnou strukturu a velikost vláken zůstává stejná jako u normální fibrinové sraženiny (kontrola vs. sraženina UHRA 0,5 mg/ml, p = 0,12) (obr. 3). Na druhé straně fibrinové sraženiny vytvořené v přítomnosti 0,05 mg/ml PS (klinická dávka) zvětšily velikost vláken a dramaticky změnily strukturu sraženiny (kontrola vs sraženina PS 0,05 mg/ml, p< 0,0001). Naše studie lýzy plazmatické sraženiny v přítomnosti exogenního t-PA ukazují, že UHRA na rozdíl od protaminu nezvýšila degradaci sraženiny. UHRA obnovila hladinu trombinu v antikoagulované PRP (heparinizované), což prokazuje účinnost.

Závěr a význam

Naše studie prokazují, že univerzální heparinové antidotum, UHRA, má zanedbatelný vliv na fibrinogen, polymerizaci fibrinu, strukturu sraženiny, degradaci sraženiny a koagulační systém, což odhaluje jejich vynikající hemokompatibilitu ve srovnání s protaminem. Naše výsledky podporují skutečnost, že UHRA by mohla být ideálním antidotem k obnovení hemostázy po invazivních chirurgických výkonech a k řešení krvácivých komplikací antikoagulancii na bázi heparinu.

Žádný relevantní střet zájmů, který by bylo třeba deklarovat.