Test propustnosti Caco-2
Otázky a odpovědi k testu propustnosti Caco-2
Prosím o přehled testu propustnosti Caco-2 společnosti Cyprotex.
Buňky Caco-2 jsou široce používány jako in vitro model pro předpověď absorpce léčiv u člověka. Buněčná linie Caco-2 je odvozena z lidského kolorektálního karcinomu a při kultivaci se buňky spontánně diferencují do monovrstev polarizovaných enterocytů.
Buňky se vysévají na destičky s více jamkami a vytvářejí splývající monovrstvu po dobu 20 dnů před experimentem. Dvacátý den se na apikální stranu membrány přidá testovaná sloučenina a sleduje se tok sloučeniny přes monovrstvu po dobu 2 hodin. Pro studium efluxu léčiva je také nutné zkoumat transport sloučeniny z bazolaterálního kompartmentu do apikálního.
Koeficient permeability (Papp) se vypočítá z následující rovnice:
Kde dQ/dt je rychlost permeace léčiva přes buňky, C0 je koncentrace donoru v nulovém čase a A je plocha buněčné monovrstvy.
Jak interpretovat údaje z testu permeability Caco-2?
Existuje několik způsobů, jak lze údaje z testu permeability Caco-2 použít. Zaprvé lze sloučeniny seřadit podle jejich hodnot Papp. Vedle zkoušených sloučenin se prověřují dvě referenční sloučeniny, atenolol (pasivní paracelulární transport) a propranolol (pasivní transcelulární transport). Atenolol a propranolol mají známou absorpci u člověka 50 %, resp. 90 %2,3 a mohou být použity jako markery pro hodnocení testovaných sloučenin. Za druhé lze údaje použít ve spojení s dalšími parametry in vitro k předpovědi perorální farmakokinetiky sloučeniny in vivo pomocí simulačního softwaru Cloe PK. Zatřetí lze údaje z Caco-2 použít k předpovědi propustnosti krevní mozkové bariéry (BBB) (obrázek 3).
Korelace mezi Pactive ((PappB-A – PappA-B)/2) odvozeným z Caco-2 a rychlostí prostupu BBB in situ, logPS (součin propustnosti a plochy povrchu). Léčiva, o nichž je známo, že prostupují BBB (kofein, imipramin, progesteron), mají logPS >-2,0 (zeleně stínovaná oblast), zatímco léčiva, o nichž je známo, že BBB neprostupují (aldosteron, hydrokortizon, cimetidin), mají logPS ≤-3,5 (růžově stínovaná oblast).
Zobrazena je regresní přímka, která ukazuje jasnou korelaci mezi Pactive a logPS pro sloučeniny, které nepodléhají významné úrovni efluxní aktivity v buňkách Caco-2, tj, pro sloučeniny s Pactive < 5 × 10 -6 cm/s. Pomocí této korelace lze test Caco-2 společnosti Cyprotex použít k vyhodnocení potenciálu BBB pro sloučeniny s Pactive < 5 × 10 -6 cm/s.
Jaký je vztah mezi propustností Caco-2 a lidskou střevní absorpcí?
Vztah mezi propustností Caco-2 (s použitím pufrů HBSS o pH7,4 v apikálním i bazolaterálním oddílu) a lidskou střevní absorpcí je zobrazen na obrázku 4. Tato korelace je typická pro korelace pozorované v literatuře pro tyto dva parametry4. Je důležité poznamenat, že tento graf je ovlivněn přesností údajů o střevní absorpci. Hodnoty střevní absorpce použité v tomto grafu jsou převzaty od Zhao et al. 20012. V tomto článku byly údaje o lidské střevní absorpci získány z různých zdrojů a jejich kvalita se značně liší. Je také známo, že některé sloučeniny vykazují absorpci závislou na dávce (na grafu jsou znázorněny chybovými úsečkami).
Souvislost mezi permeabilitou Caco-2 a % lidské střevní absorpce.
Jaké jsou rozdíly mezi testem permeability PAMPA a Caco-2?“
Test permeability Caco-2 je považován za reprezentativnější pro lidskou absorpci in vivo než PAMPA (paralelní test permeability umělých membrán). PAMPA poskytuje pouze míru pasivní difuze, zatímco model Caco-2 poskytuje lepší předpověď lidské absorpce u sloučenin, které vykazují aktivní absorpci nebo eflux nebo procházejí membránou paracelulární cestou. Informace z obou testů použité společně mohou být cenné při identifikaci hlavní příčiny špatné absorpce.
Jak změřím eflux léčiva?
Provádí se obousměrný test permeability Caco-2, kde se měří transport sloučeniny v apikálním směru k bazolaterálnímu i v bazolaterálním směru k apikálnímu. Výsledek se obvykle uvádí jako poměr efluxu, tj. Papp(B-A)/Papp(A-B). Pokud je poměr efluxu větší než dvě, znamená to, že dochází k efluxu léčiva. Talinolol, známý substrát P-gp, se zkouší jako kontrolní sloučenina, aby se potvrdilo, že buňky exprimují funkční efluxní transportní proteiny.
Jak zjistíte, zda buňky vytvořily splývající monovrstvu?
Měření elektrického odporu transepitelií (TEER) se používá k určení vytvoření těsného spoje mezi buňkami. Kromě toho se na začátku experimentu koinkubuje luciferová žluť, marker membránové integrity, s testovanou sloučeninou. Pokud Papp luciferové žluti překročí 1,0 × 10 -6 cm/s v jedné jamce, ale odvozený výsledek Papp pro testovanou sloučeninu nebo kontrolní sloučeninu v této jamce je kvalitativně podobný výsledku stanovenému ve zbývajících opakovaných jamkách (v rámci prahové hodnoty luciferové žluti), pak lze na základě vědeckého úsudku odpovědného vědce považovat buněčnou monovrstvu za přijatelnou. Pokud tomu tak není, výsledek z postižené monovrstvy se vyloučí a uvede se výsledek n=1, nebo se sloučenina může znovu otestovat. Pokud jsou ovlivněny obě repliky, sloučenina se znovu testuje. Pokud obě hodnoty luciferové žluti Papp pro stejnou sloučeninu při dvou různých příležitostech selžou, pak se předpokládá, že sloučenina vykazuje buď cytotoxické účinky vůči buňkám Caco-2, nebo inherentní fluorescenci.
Jak a proč se vypočítává % výtěžnosti?
Procentní výtěžnost může být užitečná při interpretaci údajů z Caco-2. V případě, že je výtěžnost nižší než %, pak se použije výtěžnost v %. Pokud je výtěžnost velmi nízká, může to znamenat problémy se špatnou rozpustností, vazbou sloučeniny na destičku, metabolismem v buňkách Caco-2 nebo akumulací sloučeniny v buněčné monovrstvě.
.
Leave a Reply