Původ elektroforetické síly na DNA v nanopórech v pevné fázi

Napětím řízený transport makromolekul přes biologické6,7 a umělé8,9,10,11,12 nanopóry představuje ideální systém pro studium fyziky translokačního procesu13. Elektroforetická migrace je hlavní hnací silou translokace DNA přes nanopory a je důsledkem síly působící vnějším elektrickým polem na náboje na řetězci polyelektrolytu. Jelikož je DNA v roztoku záporně nabitá, je stíněna vrstvou více či méně pohyblivých, kladně nabitých protiiontů, na které rovněž působí elektrické pole. Již dlouho je známo, že síla působící na protiionty vyvolává hydrodynamickou odporovou sílu na DNA, která lokálně vyrovnává elektrickou sílu, což vede k mnohem pomalejší migraci, než by se dalo očekávat pouze na základě Stokesova odporu (viz např. ref. 1). Elektroforetická translokace polymeru malým pórem se řídí podobnými principy, ale zde se očekává, že geometrie póru (nebo lokální struktura gelu) zásadně ovlivní hydrodynamický profil proudění kolem DNA, a tím i odporovou sílu bránící pohybu1,5,14 . Navzdory stále sofistikovanějším experimentům3,12,15,16 nebyl dosud popsán jednoznačný projev hydrodynamických interakcí při translokaci DNA. Zde se touto otázkou zabýváme s využitím našeho nedávno vyvinutého přístroje kombinujícího nanopóry v pevné fázi s optickou pinzetou3 , který slouží k zastavení translokace DNA a následnému měření brzdné síly na jednom vlákně DNA (viz oddíl Metody). Schéma měřicí aparatury je uvedeno na obr. 1a.

a, Schéma měřicí aparatury. Pomocí optické pinzety se zastaví translokace DNA a měří se síla působící na DNA. Současně se měří také iontová vodivost nanoporů. b, Válcový model DNA v nanoporu. Modré šipky na obou stranách DNA schematicky znázorňují rychlost pohybující se tekutiny v důsledku elektroosmózy.

Na rozdíl od experimentu s gelovou elektroforézou je elektrické pole při experimentu s nanopóry omezeno na bezprostřední okolí póru a elektrické síly působí lokálně na krátký úsek DNA. Intenzita elektrického pole v póru obvykle dosahuje ∼106 V m-1 díky velmi tenkým (∼60 nm) volně stojícím membránám. Velká perzistenční délka λ-DNA, přibližně 50 nm, zajišťuje, že segment DNA uvnitř póru je prakticky plně vysunut. Situace je schematicky znázorněna na obr. 1b, kde L a R představují délku a poloměr póru a ΔV je aplikovaný potenciál. DNA má hustotu náboje holé linie λbare=-0,96 nC m-1 (2 elektrony na pár bází) a je zde modelována jako rovnoměrně nabitý válec o poloměru a=1,1 nm. Holá elektrostatická síla na páteř DNA je reprezentována vztahem Fbare=λbareΔV (cit.3 ). Proti ní působí odporová síla Fdrag způsobená elektroforetickým pohybem protiiontů v opačném směru: Fdrag je tedy vnitřní složkou procesu translokace, která je v konečném důsledku také odvozena od elektrických sil5. Výsledná čistá síla je elektroforetická síla, která pohání translokaci a je dána vztahem Felec=Fbare-Fdrag. V našem případě je Felec vyrovnáván opačnou mechanickou silou Fmech=-Felec z optické pinzety, která zadržuje DNA uvnitř póru.

Původ Fdrag spočívá v prostorovém rozložení iontů a odpovídajícím profilu proudění tekutiny. Popis středního pole rozložení iontů je dán Poissonovým-Boltzmannovým formalismem, ve kterém je elektrostatický potenciál dán a odpovídající rozložení iontů jako . Zde λD je Debyeova délka, je redukovaný elektrostatický potenciál, e je elementární náboj, Φ je potenciál, kB je Boltzmannova konstanta, T je teplota, n je hustota počtu iontů a z je valence iontového druhu. Obrázek 2a ukazuje vypočtené potenciály pro dvě velikosti pórů získané numerickým vyhodnocením Poissonovy-Boltzmannovy rovnice ve válcové geometrii (viz oddíl Metody). Odpovídající rozložení iontů je znázorněno na obr. 2b. Debyeho vrstva DNA se vyznačuje vyčerpáním koiontů, zatímco protiionty se díky vysokému náboji DNA hromadí do velmi vysokých hustot. Vzhledem k tomu, že tato rozložení jsou řešením úplné (nelinearizované) Poissonovy-Boltzmannovy rovnice, je v nich zahrnut vliv Manningovy kondenzace17.

a, Redukovaný elektrostatický potenciál pro „velký“ pór (zeleně, R=10 nm) a „malý“ pór (modře, R=3 nm). Šedá čára označuje polohu stěny póru pro malý pór. Koncentrace soli je cbulk=20 mM (λD=2,2 nm) a stěny pórů jsou v tomto konkrétním výpočtu pro zjednodušení považovány za nenabité. b, Odpovídající rozložení iontů. Ve „velkých“ pórech (R≫λD) není rozložení iontů kolem DNA stěnou póru významně ovlivněno, jak naznačuje pozorování, že zelené křivky dosahují objemové hodnoty. V „malých“ pórech (R≲λD) je však oblak protiiontů (plné křivky) stlačován stěnou póru a pór může být ochuzen o ionty (čárkované křivky), takže zůstávají hlavně kladné protiionty, které vyvažují záporné náboje na DNA. Tuto situaci ilustrují modré křivky. c, Rychlostní profily tekutiny vypočtené kombinací výsledků z a a b se Stokesovou rovnicí. d, Normalizovaný povrchový integrál smykového napětí v každé poloze r, vypočtený jako , přičemž τ je smykové napětí v tekutině. Na povrchu DNA . e, Vypočtené redukované povrchové potenciály pro DNA (červeně) a stěnu nanopóru (šedě) jako funkce poloměru póru. Šedá oblast kvalitativně znázorňuje oblast „malých pórů“, ve které je rozložení iontů ovlivněno uzavřeností nanopóru.

V našem experimentu se zastavením DNA distribuce protiiontů do značné míry určuje rychlostní profil indukovaného elektroosmotického toku. Rychlostní profil proudění lze vypočítat řešením Stokesovy rovnice , kde η je dynamická viskozita tekutiny, vz je rychlost tekutiny, Ez je přiložené elektrické pole a ρ(r) je rozložení iontového náboje. Vypočtené profily proudění kapaliny jsou znázorněny na obr. 2c. Následně se pro vztah mezi profilem proudění a viskózním odporem vypočítá smykové napětí v kapalině jako τ(r)=-η(dvz/dr). Na obr. 2d je znázorněno , které se při vyhodnocení na povrchu DNA (r=a) rovná poměru Fdrag/Fbare. Ukazuje, že Fdrag je stejného řádu jako holá elektrostatická síla působící na DNA, které odporuje. Fdrag je větší pro větší póry, což odpovídá menší brzdné síle.

Pro srovnání s našimi experimenty je vhodné vyjádřit výše uvedený model ve formě, která přímo vztahuje elektroforetickou sílu k vlastnostem nanoporu. Jak bylo ukázáno dříve5 , Poissonovy-Boltzmannovy a Stokesovy rovnice lze kombinovat a získat tak výraz pro elektroforetickou sílu na stacionární molekulu,

Φ(a) a Φ(R) jsou povrchové potenciály DNA, resp. nanoporu, a ε je dielektrická konstanta vody. a odvozené z Poissonovy-Boltzmannovy rovnice jsou vyneseny na obr. 2e jako funkce R. Ve velkých pórech jsou povrchové potenciály nezávislé na R. Rovnice (1) pak předpovídá, že naměřená síla Fmech má jednoduchou závislost ln-1(R/a) na velikosti póru. V menších pórech je naopak Debyeova vrstva stlačována stěnou póru (obr. 2). To má za následek závislost povrchových potenciálů na velikosti póru a odpovídajícím způsobem komplikovanější závislost Fmech na R.

Způsobem, jak přímo otestovat výše uvedený model, je změřit sílu Fmech na zdržení DNA v závislosti na poloměru póru R. Protože se však předchozí práce zaměřovaly na menší póry, nejprve ukážeme, že je možné detekovat přítomnost jediné molekuly DNA ve velmi velkých (R≫a) nanopórech. Detekce DNA v póru je založena na měření skoku v iontové vodivosti ΔG při vstupu DNA do póru. Již dříve se ukázalo, že ΔG je způsobena konkurencí mezi dvěma příspěvky: objemovou exkluzí, která snižuje počet iontů dostupných pro vodivost, a přebytkem protiiontů DNA, který účinně zvyšuje počet iontů dostupných pro vodivost12. Který z těchto dvou efektů převažuje, závisí na objemové koncentraci elektrolytu, což způsobuje, že ΔG je v současných experimentech s 20-50 mM soli kladné (zvýšení vodivosti). Za těchto optimalizovaných podmínek soli se předpokládá, že poměr signálu k šumu při záchytu DNA bude vysoký i ve velmi velkých pórech18. Typický krok proudu spolu s odpovídající změnou polohy Z kuličky je znázorněn na obr. 3a. Pozorujeme zřetelný krok v proudu, přestože DNA mění vodivost nanopóru o méně než 1 %. Typický histogram zachycených událostí je znázorněn na obr. 3b. Tato data ukazují, že jsme schopni řízeně vkládat a detekovat jednotlivé molekuly i do nanopórů s R=45 nm, kde DNA pokrývá pouze 1/2000 plochy průřezu nanopóru.

a, Typický příklad pórového proudu I (horní panel, červené zprůměrování) a polohy kuličky Z (dolní panel) během zachycení DNA v póru s R=39 nm v 33 mM KCl při 80 mV. Měření proudu bylo filtrováno dolní propustí při 1 kHz. b, Histogram ΔG 88 zachycených DNA v nanoporu za stejných podmínek jako v a. c, ΔG v pórech o různých poloměrech. K zachycení obvykle docházelo při napětí 60-100 mV. Vodorovná přerušovaná čára je vodítkem pro oko. Trojúhelníky: 20 mM KCl, hvězdičky: 33 mM KCl, kosočtverce: 50 mM KCl, zelená hvězdička: údaje z bodu b, chybové úsečky: směrodatná odchylka vyhodnocená z histogramů ΔG. Otevřené symboly představují data z experimentů s volnou translokací bez optické pinzety.

Experimentálně stanovené hodnoty ΔG v závislosti na poloměru nanoporů jsou uvedeny na obr. 3c pro 10 nanoporů s poloměry od R=3 do 45 nm. Šedá oblast označuje oblast „malých pórů“, ve které je podle výpočtů na obr. 2b rozložení iontů v blízkosti DNA ovlivněno přítomností stěny nanopóru. Ve zjevném souladu se simulacemi je ΔG ve velkých nanopórech přibližně konstantní. Větší ΔG v malých nanopórech je v souladu se stlačením difúzní stínicí vrstvy, která zajišťuje nábojovou neutralitu v pórech. Kvantitativnější srovnání naměřeného ΔG s teorií je však obtížné: přístupový odpor Racc se ve velkých pórech stává stále významnějším příspěvkem k celkovému odporu systému19 a v současné době není známo, jak přítomnost DNA procházející pórem ovlivňuje Racc.

Když jsme zjistili, že je možné zastavit a detekovat molekuly DNA ve velkých i malých pórech, přejdeme nyní k hlavnímu výsledku tohoto dopisu, a to k experimentálně stanovené velikosti zastavovací síly Fmech v závislosti na poloměru nanopóru R. Obrázek 4a ukazuje Fmech jako funkci přiloženého napětí ΔV v nanopórech s R=4 nm (levý panel) a R=39 nm (pravý panel). Tento vztah je v obou případech přibližně lineární. Fmech/ΔV v malém póru je však dvakrát větší než ve velkém póru. Obrázek 4b ukazuje poměr Fmech/ΔV v závislosti na velikosti póru: Fmech/ΔV postupně klesá s rostoucí velikostí, jak se očekávalo na základě rovnice (1). Čárkovaná křivka je výsledkem kombinace povrchových potenciálů pro plný náboj DNA (obr. 2e) s rovnicí (1) bez dalších úprav. Navzdory přirozeným zjednodušením jednorozměrného modelu teoretický výsledek poměrně dobře zachycuje trend v datech, ačkoli kvantitativně nadhodnocuje brzdnou sílu o ∼50 %. Tento rozdíl lze přičíst (kombinaci) několika faktorů, včetně snížení pohyblivosti protiiontů na povrchu DNA12,20 nebo dodatečného protichůdného elektroosmotického proudění tekutiny v důsledku pevných nábojů na povrchu nanoporů5. Z hlediska rovnice (1) lze oba efekty reprezentovat snížením velikosti rozdílu povrchových potenciálů ΔΦ=Φ(a)-Φ(R), čímž se sníží velikost Fmech. Empirické snížení ΔΦ o 33 % vede k plné křivce na obr. 4b, která výborně odpovídá experimentálním datům. Toto snížení ΔΦ odpovídá tomu, že přibližně 50 % holého náboje DNA je stíněno ionty, které jsou účinně imobilizovány na jejím povrchu (jak ukazuje doplňkový obr. S1), nebo přítomnosti povrchového náboje 15 mC m-2 na stěně póru (doplňkový obr. S2). Ačkoli náš experiment nemůže přímo rozlišit mezi těmito dvěma mechanismy, odvozená hustota povrchového náboje je typická pro povrchy SiO221. To naznačuje, že hustota povrchového náboje v našich nanopórech není silně ovlivněna výrobním procesem a že náboj pórů je zodpovědný za podstatnou část pozorované korekce.

a, Měření zastavovací síly jako funkce aplikovaného potenciálu v malém (levý panel) a velkém nanopóru (pravý panel). V každém případě jsou zobrazena dvě měření získaná v různých vzdálenostech mezi kuličkou a nanopórem. b, Naměřená síla v závislosti na poloměru póru. Modré a zelené symboly odpovídají údajům v bodě a. Údaje v oblasti malých pórů byly převzaty z cit. 3. Křivky představují teoretický výsledek pro holý náboj DNA (čárkovaná křivka) a pro redukovaný ΔΦ (plná čára, viz text). Vložka schematicky ukazuje, jak je síla působící na protiionty DNA rozdělena mezi DNA a stěny póru prostřednictvím viskózního odporu v malém a velkém póru; žlutá šipka představuje holou elektrostatickou sílu působící na DNA. Trojúhelníky: 20 mM KCl, hvězdičky: 33 mM KCl, kosočtverce: 50 mM KCl. Chybové úsečky vyplývají z nejistot kalibrace optické pasti, které se odhadují na 10-30 % kalibrované tuhosti pasti.

Vnější faktory, které nejsou v našem jednoduchém modelu zohledněny, mohou ovlivnit i absolutní hodnotu brzdné síly. Může být například vychýlena elektrostatickými a/nebo hydrodynamickými silami na kuličce nebo na části DNA, která se nachází v elektrickém poli těsně mimo nanopór. Naše experimenty však takové vlivy neprokázaly, protože jsme nezjistili žádnou změnu v zastavovací síle, když byla kulička umístěna v rostoucí vzdálenosti od nanopóru3. Kromě toho jsou experimentální křivky závislosti síly na napětí v našem rozsahu napětí lineární (obr. 4a), což naznačuje, že entropické síly jsou ve srovnání s elektrostatickými silami malé, což je v souladu s nezávislými měřeními entropických sil při natahování DNA22.

Závislost naměřené síly na poloměru póru na obr. 4b přímo ukazuje, že elektroforetická síla při translokaci DNA je částečně určena hydrodynamickou vazbou mezi protiionty DNA a stěnou nanoporu. Geometrie nanoporů určuje velikost odporové síly, kterou tyto protiionty působí na DNA. Tato vazba má důležité důsledky pro interpretaci experimentálně stanovených sil, protože tyto síly zjevně nejsou určeny pouze vnitřními vlastnostmi DNA1,23.

Změny síly lze také očekávat s rostoucí koncentrací soli, protože se tím mění Debyeova délka, a tím i povrchový potenciál DNA a pravděpodobně i brzdná síla Fmech. Toto očekávání však komplikují skutečnosti, že s koncentrací soli se výrazně mění i hustota povrchového náboje pórů12 a že zde použitá teorie středního pole se při vysoké iontové síle stává nespolehlivou. V předchozích experimentech bylo zjištěno, že Fmech ve skutečnosti nezávisí na koncentraci soli až do 1 M (cit.3 ), a interpretaci těchto údajů založenou na modelu, v němž Φ(R) závisí na koncentraci soli, navrhl Ghosal5.

Při volné translokaci DNA chybí obnovující síla Fmech a je fakticky nahrazena dodatečným Stokesovým odporem FStokes úměrným rychlosti molekuly. Molekula se přemisťuje konstantní rychlostí, přičemž elektroforetická síla je vyrovnávána silou FStokes. Vztah mezi brzdnou silou Fmech, měřenou optickou pinzetou, a translokační rychlostí vtrans, stanovenou z experimentů s volnou translokací DNA, je dán vztahem4,5,14

Tento výsledek je ekvivalentní Stokesovu odporu, který by zažil nenabitý válec translokující válcovým pórem konstantní rychlostí vtrans. Fmech a vtrans jsou tedy úměrné veličiny, které souvisejí s činitelem závislým na geometrii. Toto očekávání kvalitativně potvrzují experimentální údaje3,12 , které ukazují, že Fmech a vtrans jsou skutečně přibližně úměrné. Výpočet vtrans jako podíl délky obrysu λ-DNA a experimentálně stanovené doby translokace dává vtrans=(16 μm/1,1 ms)≈15 mm s-1, což znamená Fmech/vtrans=1 750 pN s m-1 (údaje pro póry o poloměru 5 nm). Rovnice (2) však dává pro tento faktor hodnotu 249 pN s m-1 při použití η=1×10-3 N s m-2, L=60 nm, R=5 nm a a=1,1 nm. To je sedmkrát méně než experimentálně získaná hodnota. K translokaci DNA těmito póry tedy dochází mnohem nižší rychlostí, než se očekává na základě elektroforetických sil naměřených pomocí optické pinzety a popisu středního pole. Vzhledem k tomu, že ve všech těchto experimentech byly použity podobné nanopóry, ukazuje tento závěr na zásadnější rozdíl mezi statickou situací zastavené molekuly a dynamickou situací translokující molekuly. Při volné translokaci DNA vede konformace DNA mimo pór k dodatečnému odporu pohybující se molekuly24 , což může vysvětlovat tento rozdíl.

Závěrem jsme ukázali, že elektroforetická síla na molekulu DNA v nanoporu závisí na geometrii póru. To se neočekává z prosté elektrostatiky, ale lze to pochopit jednoduše, když vezmeme v úvahu hydrodynamický odpor vyvolaný protiionty stínícími DNA v roztoku. Numerické výpočty založené na rovnicích středního pole poskytují dobrý popis závislosti naměřených sil na velikosti póru

.