Přehled klasických enzymů histondeacetyláz a inhibitorů histondeacetyláz

Krátce, inhibitory HDAC vedou k akumulaci hyperacetylovaných histonů a bylo prokázáno, že mění expresi přibližně 2-20 % genů v maligních buněčných liniích . Celkově bylo prokázáno, že inhibitory HDAC snižují buněčnou proliferaci, vyvolávají buněčnou smrt, apoptózu a diferenciaci, způsobují zástavu buněčného cyklu (G1 při nižších koncentracích a G1 i G2/M při relativně vysokých koncentracích) a snižují migraci, invazi a angiogenezi u maligních a transformovaných buněčných linií . Účinky inhibitorů HDAC jsou mnohem méně výrazné, nejméně desetinásobně, v normálních buňkách, což je základem jejich klinické využitelnosti u nádorových onemocnění . Pro potenciální zlepšení terapeutického indexu inhibitorů HDAC v terapii rakoviny byly navrženy třídně selektivní nebo izoformně specifické sloučeniny. V této souvislosti jsou příkladem izoformově specifické tubacin a PC-34051, které selektivně inhibují HDAC6, respektive HDA8. U obou sloučenin byly nedávno prokázány protinádorové účinky . Otázka selektivity však zůstává kontroverzní, přičemž argumenty naznačují, že pleiotropní účinky širokospektrých inhibitorů HDAC, které jsou obecně dobře snášeny, mohou být pro léčbu rakoviny výhodné vzhledem k heterogenitě a adaptabilitě maligních buněk. Obecně se však uznává, že selektivní sloučeniny budou s největší pravděpodobností výhodnější pro neonkologické aplikace inhibitorů HDAC, které potenciálně zahrnují léčbu srdeční hypertrofie, astmatu a různých neurodegenerativních poruch .

3. Kombinovaná terapie s inhibitory histondeacetylázy

Ačkoli mají vlastní protinádorové účinky, obecně se uznává, že inhibitory HDAC budou nejúčinnější při použití v kombinaci s jinými protinádorovými modalitami. Existuje řada kombinací, které v současné době procházejí preklinickým a klinickým hodnocením. Patří mezi ně kombinace s inhibitory metyltransferáz, jako je azacitidin, receptorovými cytotoxickými látkami, jako je kyselina retinová, a fototerapií . Abychom zdůraznili výhody a potenciální složitosti, zaměříme se zde na kombinace inhibitorů HDAC s konvenčními antracyklinovými chemoterapeutiky a radioterapií (obrázek 3).

(a)

(b)

(a)
(b)

.

Obrázek 3

Molekulární dráhy vysvětlující aditivní a/nebo synergické účinky kombinací inhibitorů HDAC s chemoterapeutiky nebo zářením. (a) Zjednodušené schematické znázornění. Aditivní a/nebo synergické cytotoxické účinky při použití kombinací inhibitorů HDAC a chemoterapeutik mohou být důsledkem změn konformace chromatinu zprostředkovaných histon-acetylací jako takovou (zejména v případech, kdy se používají kombinace s léčivy zaměřenými na DNA, jako jsou antracykliny, které vyžadují přístup k DNA). Podobně mohou inhibitory HDAC zvyšovat cytotoxické účinky ionizujícího a ultrafialového (UV) záření tím, že zvyšují přístupnost DNA k poškození. Další mechanismus zahrnuje regulaci transkripce genů zprostředkovanou HDACi – zejména snížení exprese genů pro Ku70, Ku86, DNA-PKcs a Rad51, které jsou klíčovými složkami cest opravy dvouřetězcových zlomů. Paradoxně se ukázalo, že inhibitory HDAC chrání před účinky ionizujícího záření in vivo snížením exprese zánětlivých cytokinů, jako jsou tumor nekrotizující faktor, TNF-α a fibrogenní růstové faktory, jako jsou TGF-β1 a TGF-β2. (b) Trichostatin A (TSA) zvyšuje poškození DNA vyvolané fototerapeutiky zaměřenými na DNA (UVASens), ionizujícím zářením a chemoterapeutiky. V uvedeném příkladu byla tvorba dvouřetězcových zlomů DNA hodnocena pomocí barvení na ložiska γH2AX. Buňky byly ošetřeny 1 μM TSA po dobu 24 hodin před hodinovou inkubací s 0,1 μM UVASens. Poté byly buňky ozářeny 10 J/m2 UVA a inkubovány další hodinu před barvením na γH2AX. Vyobrazeny jsou také příslušné kontroly s 10 J/m2 a pouze s UVASens. V samostatných experimentech byly buňky ošetřeny 1 μM TSA po dobu 24 hodin před ozářením 2 Gy (137Cs). Hodinu po ozáření byly buňky obarveny na ložiska γH2AX. V dalších experimentech byly buňky ošetřeny 1 μM TSA po dobu 24 hodin před hodinovou inkubací s 1 μM doxorubicinu. Buňky byly promyty a inkubovány dalších 24 hodin před barvením na γH2AX.

Antracykliny, jejichž typickým představitelem je daunomycin a jeho strukturní analog doxorubicin, jsou chemoterapeutika první linie léčby rakoviny s klinickou historií trvající více než 50 let . Jsou to dobře známé interkalátory DNA a inhibitory enzymu topoizomerázy II. Mechanismus účinku antracyklinů zahrnuje inhibici syntézy RNA, tvorbu reaktivních forem kyslíku a akumulaci lézí DNA, včetně zvláště smrtelných dvouřetězcových zlomů DNA . Množství studií prokázalo, že inhibitory HDAC mohou zesílit cytotoxické účinky antracyklinů. Bylo například prokázáno, že trichostatin A zvyšuje apoptózu a buněčnou smrt vyvolanou doxorubicinem u lidských erytroleukemických buněk K562, anaplastického karcinomu štítné žlázy a buněk alveolárního adenokarcinomu A549 . Podobně bylo prokázáno, že SAHA a kyselina valproová zvyšují citlivost maligních buněk k účinkům doxorubicinu . Inhibitory HDAC indukují hyperacetylaci histonů, což vede k otevřenější transkripčně permisivní konformaci chromatinu, což bylo ověřeno testy štěpení MNase . Kromě toho bylo prokázáno, že inhibitory HDAC zvyšují počet vazebných míst a také afinitu těchto míst pro antracykliny v acetylovaném chromatinu . Proto lze spekulovat, že inhibitory HDAC mohou zvýšit buněčnou smrt vyvolanou antracykliny, alespoň částečně, změnou architektury chromatinu. Na změnách genové exprese a změně funkce nehistonových substrátů zprostředkovaných inhibitory HDAC se však také podílí, jak zdůraznily studie s inhibitory selektivními pro izoformy .

Aditivní a/nebo synergický cytotoxický účinek poskytuje základ pro klinické studie využívající kombinace inhibitorů histonových deacetyláz a antracyklinů u různých malignit . Byly však zjištěny potenciální komplikace. Například bylo prokázáno, že depsipeptid zvyšuje regulaci genu MDR1 v leukemických buňkách, což vede k rezistenci na doxorubicin . Je známo, že exprese P-glykoproteinové pumpy kódované genem MDR1 vede k multirezistenci, což je hlavní klinický problém v onkologii, a další studie naznačily možnost zvrácení represe genu MDR1 v maligních buňkách pomocí různých inhibitorů HDAC . Jiné novější studie naopak naznačily, že inhibitory HDAC mohou potlačovat expresi ABC transportérů, což zdůrazňuje, že tato otázka vyžaduje další objasnění .

Další možnou komplikací při použití inhibitorů HDAC je srdeční toxicita. Studie ukázaly, že širokospektré inhibitory HDAC mohou mít samy o sobě kardiotoxickou aktivitu . Další studie ukázaly, že předléčení inhibitory HDAC zesiluje poškozující a cytotoxické účinky doxorubicinu na DNA v systémech buněčných kultur . Je dobře známo, že vedlejším účinkem omezujícím dávku antracyklinů je ireverzibilní srdeční toxicita způsobená tvorbou reaktivních forem kyslíku včetně škodlivých hydroxylových radikálů a peroxidu vodíku . Kardiomyocyty jsou obzvláště náchylné vzhledem k tomu, že mají ve srovnání s jinými typy buněk relativně nízké hladiny superoxidových aniontů a enzymů detoxikujících peroxid vodíku . Studie využívající hypertrofické reakce a indukce dvouřetězcových zlomů DNA jako koncových bodů ukázaly, že širokospektré inhibitory HDAC, trichostatin A, kyselina valproová a butyrát sodný, zvyšují účinky doxorubicinu . Podobně studie in vivo zdůrazňují kontroverze týkající se biologie inhibitorů HDAC v srdci. Nedávná zjištění například ukazují, že trichostatin A a kyselina valproová chrání před hypertrofií srdce vyvolanou zátěží a agonisty in vivo . Kontrastní nálezy však ukazují, že trichostatin A zhoršuje dysfunkci pravé komory vyvolanou bandáží plicní tepny u potkanů . Vzhledem k těmto možným komplikacím může kombinace selektivnějších nebo izoformně specifických inhibitorů HDAC s konvenčními terapeutiky přinést terapeutickou výhodu. V této souvislosti nedávná studie zjistila, že látka selektivní pro HDAC6, tubacin, potencuje účinky doxorubicinu a etoposidu u transformovaných buněčných linií . Očekávají se další hodnocení v tomto směru.

4. Kombinace inhibitorů histondeacetylázy s radioterapií

Předchozí studie ukázaly, že mastná kyselina s krátkým řetězcem, butyrát sodný, potencuje cytotoxické účinky buněk rakoviny tlustého střeva a nosohltanu vůči ionizujícímu záření . Ačkoli byl k popisu tohoto účinku použit neobvyklý mechanismus, další studie ukázala, že prototypický inhibitor HDAC, trichostatin A, rovněž zvyšuje radiosenzitivitu maligních buněk . Další studie tato zjištění potvrdily a ukázaly, že prakticky všechny širokospektré inhibitory HDAC včetně trichostatinu A, SAHA, depsipeptidu, butyrátu sodného, fenylbutyrátu, tributyrinu a kyseliny valproové potencují radiací indukovanou buněčnou smrt maligních buněk . Při relativně vysokých koncentracích inhibitoru HDAC byly pozorovány faktory modifikace dávky (poměr dávek záření v buňkách léčených a neléčených inhibitorem HDAC, které vedou ke stejné úrovni přežití) ~2 . Při těchto vyšších koncentracích se spekuluje, že zástava buněčného cyklu (G1 a G2), inhibice syntézy DNA a indukce apoptózy inhibitory HDAC vysvětlují senzibilizační účinek záření . Při relativně nižších koncentracích inhibitorů HDAC je rovněž pozorován radiační senzibilizační účinek. Řada studií prokázala souvislost mezi inhibicí HDAC a proteiny zapojenými do signálních kaskád v reakci na poškození DNA . Souhrnně lze říci, že radiačně senzibilizující účinky inhibitorů HDAC mohou zahrnovat následující mechanismy. Za prvé, hyperacetylace histonů mění architekturu chromatinu, což vede k potvrzení otevřenějšího chromatinu, který může být náchylnější k počátečnímu poškození DNA vyvolanému zářením. Dále mohou inhibitory HDAC interagovat s klíčovými proteiny přenosu signálu zapojenými do drah odpovědi na poškození DNA. A konečně bylo prokázáno, že inhibitory HDAC regulují transkripci genů zapojených do dráhy opravy dvouřetězcových zlomů DNA. Bylo například prokázáno, že předběžná léčba SAHA tlumí radiací vyvolaný nárůst DNA reparačních proteinů Rad51 a DNA-PKcs . Podobně bylo prokázáno, že butyrát sodný snižuje expresi DNA reparačních proteinů Ku70, Ku86 a DNA-PKcs v melanomových buněčných liniích . Kromě toho bylo při použití bleomycinu, doxorubicinu a etoposidu k indukci dvouřetězcových zlomů DNA hodnocených podle akumulace ložisek γH2AX prokázáno, že inhibitory histonové deacetylázy se zaměřují na acetylaci Ku70, což vede k senzibilizaci .

V kontextu kombinací s radioterapií je důležitá kyselina valproová, která má dlouhou klinickou historii v léčbě epilepsie . Preklinické studie ukázaly, že inhibitor HDAC senzibilizuje lidské gliomové buněčné linie k účinkům ionizujícího záření (rentgenového záření) jak in vitro, tak in vivo . Jak bylo nedávno přezkoumáno, kyselina valproová byla kombinována s alkylační látkou temozolomidem a zářením pro potenciální léčbu multiformního glioblastomu . Tato strategie je v současné době hodnocena v rámci klinické studie fáze II .

5. Radioprotektivní účinky inhibitorů histondeacetylázy

Paradoxně se objevují důkazy, že inhibitory HDAC mají radioprotektivní účinky. První studie naznačily, že předběžná léčba fenylbutyrátem nabízí mírný radioprotektivní účinek u lidských normálních a nádorových buněk . Další studie naznačily, že fenylbutyrát chrání před kožním radiačním syndromem in vivo . Předpokládá se, že radioprotektivní vlastnosti inhibitorů HDAC zahrnují potlačení zánětlivých cytokinů (např. interleukin- (IL-) 1, IL-8, tumor nekrotizující faktor- (TNF-)α) a fibrogenních růstových faktorů (např. transformující růstový faktor- (TGF-)β) . O těchto faktorech je známo, že se podílejí na zánětlivé reakci na záření, a zejména prodloužená sekrece TNF-α a TGF-β z epiteliálních, endoteliálních a pojivových buněk se podílí na kožním radiačním syndromu . Kromě fenylbutyrátu se ukázalo, že širokospektré inhibitory HDAC trichostatin A a kyselina valproová chrání před radiačním poškozením kůže a před radiační letalitou u myší . Tyto účinky rovněž souvisely se sníženou expresí TNF-α, TGF-β1 a TGF-β2 . Další výzkum v tomto směru s fenylbutyrátem ukázal, že tento inhibitor HDAC může chránit myši před akutní letalitou vyvolanou γ zářením. Účinky souvisely s útlumem poškození DNA a apoptózy . Zajímavé je, že profylaktické a postradiační podávání fenylbutyrátu poskytovalo radioprotekci, což představuje zajímavé potenciální klinické využití. Profylaxe by byla vhodná pro radioterapii před vystavením ozáření a postradiační podání by bylo vhodné v případech neúmyslného ozáření.

6. Závěry

Inhibitory HDAC se staly důležitou novou třídou protinádorových terapeutik. Ačkoli mají samy o sobě silné cytotoxické a apoptotické účinky, předpokládá se, že budou nejužitečnější při použití v kombinaci s dalšími protinádorovými modalitami. Tomu odpovídá většina současných klinických studií, které zahrnují převážně kombinace inhibitorů HDAC s konvenčními chemoterapeutiky a radioterapií. Důležitou otázkou v této oblasti zůstává, zda třídně selektivní nebo izoformně specifické sloučeniny budou mít větší terapeutickou účinnost než klasické širokospektré inhibitory HDAC. Širokospektré inhibitory HDAC mají pleiotropní protinádorové účinky, což může být výhodné vzhledem k heterogenitě a adaptabilitě maligních buněk. Na druhé straně mohou sloučeniny selektivní podle třídy nebo izoformy nabízet větší terapeutické okno s menšími účinky mimo cíl. V současné době probíhá intenzivní výzkum zaměřený na další pochopení funkce enzymů HDAC a zvyšuje se dostupnost specifičtějších sloučenin. Proto se očekává, že otázka selektivity bude objasněna, což možná otevře další možnosti pro klinickou translaci této třídy sloučenin.

Konflikt zájmů

Jak K. Ververis, tak T. C. Karagiannis prohlašují, že nemají žádný přímý finanční vztah s komerčními subjekty uvedenými v tomto článku, který by mohl vést ke střetu zájmů.

Poděkování

Poděkování patří Australskému institutu jaderné vědy a techniky. T. C. Karagiannis byl držitelem ocenění AINSE. Laboratoř epigenomické medicíny je podporována Australskou národní radou pro zdraví a lékařský výzkum. K. Ververis je podporován postgraduálním stipendiem Baker IDI. Tento článek byl částečně podpořen Programem podpory operační infrastruktury viktoriánské vlády. Autoři by rádi poděkovali za využití zařízení poskytnutého společností Monash Micro Imaging v AMREP a zejména za odbornou pomoc doktorů Stephena Codyho a Iśky Carmichaelové.