Klinický význam exprese kanabinoidních receptorů CB1 a CB2 v maligních a benigních lézích štítné žlázy u lidí

Abstrakt

Endokanabinoidní systém je tvořen kanabinoidními receptory (CB1 a CB2), jejich endogenních ligandů (endokanabinoidů) a proteinů zodpovědných za jejich metabolismus se podílí na mnoha různých funkcích nepostradatelných pro homeostatickou regulaci v několika tkáních a působí také protinádorově. Cílem této studie bylo zhodnotit klinický význam exprese CB1 a CB2 v lidských benigních a maligních lézích štítné žlázy. Exprese proteinů CB1 a CB2 byla hodnocena imunohistochemicky na parafinových tkáních štítné žlázy získaných od 87 pacientů s benigními a maligními lézemi a byla statisticky analyzována s klinicko-patologickými parametry, proliferační kapacitou folikulárních buněk a mírou rizika recidivy odhadnutou podle stagingového systému Americké asociace pro štítnou žlázu (ATA). Zvýšená exprese CB1 a CB2 byla významně častěji pozorována u maligních než benigních lézí štítné žlázy ( a , resp.). Zvýšená exprese CB1 a CB2 byla také významně častěji pozorována u papilárních karcinomů ve srovnání s hyperplastickými uzly ( a , resp.). U maligních lézí štítné žlázy byla zvýšená exprese CB2 významně spojena s přítomností metastáz v lymfatických uzlinách . Zvýšená exprese CB2 byla rovněž častěji pozorována u maligních případů štítné žlázy s přítomností kapsulární , lymfatické a vaskulární invaze , stejně jako u případů se zvýšeným rizikem recidivy , avšak na nesignifikantní úrovni, zatímco exprese CB1 nebyla spojena s žádným ze zkoumaných klinickopatologických parametrů. Naše údaje naznačují, že receptory CB se mohou podílet na maligní transformaci štítné žlázy a zejména receptor CB2 by mohl sloužit jako užitečný biomarker a potenciální terapeutický cíl u neoplazií štítné žlázy.

1. Úvod

Endokanabinoidní systém (ECS) je endogenní systém vyvolávající lipidové signály, přítomný v různých lidských tkáních, který vykonává mnoho různých a nesouvisejících funkcí. Významné studie poukázaly na regulační účinky ECS na centrální a periferní nervový systém, gastrointestinální trakt a imunitní systém, přičemž se podílí na mnoha procesech, jako je gastrointestinální motilita, nálada, regulace bolesti, paměť a chuť k jídlu . Tyto funkce jsou spouštěny vazbou endogenních a exogenních ligandů na kanabinoidní receptory (CB receptory). Kromě těchto dobře známých funkcí má ECS také antiproliferační účinky prostřednictvím modulace několika signálních drah , přičemž jeho aktivace může mít prognostický význam pro progresi vývoje nádorů .

Existují dva podtypy receptorů CB s různou distribucí v lidských tkáních. Receptor CB1 se nachází hlavně v centrálním nervovém systému, adipocytech, játrech, pankreatu, kosterním svalstvu a T-lymfocytech . Receptor CB2 je detekován hlavně v imunitních buňkách, ale také v neuronech a dalších buňkách tvořících centrální nervový systém, jako jsou astrocyty a mikroglie, a také v cerebrovaskulárních endoteliálních buňkách . Aktivace CB receptorů inhibuje tvorbu cAMP prostřednictvím jeho spojení s Gi proteiny, což vede ke snížení fosforylace závislé na proteinkináze A (PKA-) . Receptory CB se také spojují s kinázou regulovanou extracelulárním signálem (ERK) a konkrétně s p42/p44 a p38 , které se účastní fosfatidylinositol-3-kinázy (PI3K) a ceramidové signalizace . Na ECS se vážou i další receptory, jako jsou kationtové kanály s přechodným receptorovým potenciálem, člen podrodiny V 1 (TRPV-1), receptory aktivované peroxizomovými proliferátory (PPAR) a receptory G-proteinem spřažené s jinými než CB1/CB2 GPR55 .

Ligandy ECS jsou kanabinoidy, včetně bioaktivních složek Cannabis Sativa, syntetické CB-mimetické sloučeniny a endogenní ligandy CB receptorů . Nejdůležitější molekulou první kategorie je Δ9-THC, který je dobře známý pro své psychoaktivní vlastnosti . Další dvě kategorie zahrnují syntetické ligandy, které byly v současné době vyvinuty (CP55940, HU-210, HU-211, ab-kanabidiol, kyselina ajulemová, WIN55,212-2), a endokanabinoidy, které jsou produkovány lidským organismem a jsou to lipidové messengerové deriváty kyseliny arachidonové (AA) konjugované buď s etanolaminem, nebo glycerolem . Nejdůležitějšími z těchto molekul jsou anandamid (AEA) a 2-arachidonoylglycerol (2-AG), ale byly identifikovány i další látky, například O-arachidonoylethanolamin (OAE, virodhamin), 2-arachidonoylglycerol ether (2-AGE, noladin ether), N-arachidonoyldopamin (NADA) a palmitoylethanolamid (PEA) . Kromě receptorů CB a všech jejich ligandů zahrnuje ECS také základní enzymy pro biosyntézu, transport a degradaci ligandů .

Kromě funkcí ECS za účelem udržení homeostázy se v poslední době dostává do popředí zájmu výše zmíněná křížová vazba mezi ECS a nejdůležitějšími onkogenními drahami (MAPK/ERK a dráha PI3K/Akt), která zdůraznila význam ECS v tumorigenezi . Kromě toho bylo prokázáno, že kanabinoidy indukují apoptózu u nádorových buněk, inhibují vaskularizaci nádoru prostřednictvím snížení VEGF a potlačují invazivní schopnost nádorových buněk . Převažují antiproliferační účinky a několik studií naznačuje, že kanabinoidy mají potenciál jako protinádorové látky .

Diagnostika lézí štítné žlázy se v poslední době zvýšila, a to nejen díky zdokonaleným diagnostickým technikám, ale také kvůli jejich skutečnému nárůstu výskytu v populaci . Karcinom štítné žlázy je totiž nejčastější malignitou endokrinního systému . Přestože je karcinom štítné žlázy obvykle zcela vyléčen chirurgickým zákrokem a terapií, 10-20 % pacientů stále umírá na recidivu nebo progresi nádoru . Proto je nezbytné zavést nové léčebné strategie a najít nové prognostické markery, aby bylo možné předpovědět klinický průběh u každého pacienta a podle toho přizpůsobit dostupné léčebné modality . Z tohoto hlediska bylo cílem této studie zhodnotit imunohistochemickou expresi receptorů CB1 a CB2 v benigních a maligních lézích štítné žlázy v souvislosti s klinicko-patologickými charakteristikami souvisejícími s prognózou.

2. Pacienti a metody

2.1. Pacienti a metody

2.2. Pacienti a metody Pacienti

Zkoumaný materiál tvořilo 87 histologicky vyšetřených vzorků z chirurgie štítné žlázy od stejného počtu pacientů, kteří podstoupili operaci štítné žlázy pro benigní a maligní léze. Do studie bylo zahrnuto 43 benigních (37 hyperplastických uzlů a 6 případů Hashimotovy tyreoiditidy) a 44 maligních (40 papilárních a 4 folikulární karcinomy) případů. Každý novotvar byl klasifikován podle histologické klasifikace nádorů štítné žlázy WHO . Riziko recidivy bylo odhadnuto podle systému stagingu Americké asociace pro štítnou žlázu (ATA) . Žádný z pacientů nepodstoupil před operací žádnou protinádorovou léčbu a v klinické anamnéze nebyl žádný případ ozařování hlavy a krku ani jiného nádorového onemocnění.

2.2. Imunohistochemie

Imunobarvení na CB1 a CB2 bylo provedeno na formalínem fixovaných, do parafínu vložených řezech tkáně štítné žlázy pomocí kozí polyklonální protilátky CB1 IgG (N-15, sc-10066, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) a králičí polyklonální protilátky CB2 IgG (H-60, sc-25494, Santa Cruz Biotechnology). Krátce, tkáňové řezy o tloušťce 4 μm byly odvoskovány v xylenu a přes odstupňované alkoholy byly přivedeny k vodě. Retrieval antigenu byl proveden mikrovlnným ohřevem preparátů v 10 mM citrátovém pufru (pH 6,1) po dobu 15 minut (min) při vysokém výkonu podle pokynů výrobce. Pro odstranění endogenní peroxidázové aktivity byly řezy poté ošetřeny čerstvě připraveným 0,3% peroxidem vodíku v methanolu ve tmě po dobu 30 min při pokojové teplotě. Nespecifická vazba protilátek byla blokována pomocí specifických blokovacích činidel Eraser a Sniper pro kozí a králičí primární protilátky (Biocare Medical, Concord, Kalifornie, USA) po dobu 5 min. Řezy byly inkubovány 1 hodinu (h) při pokojové teplotě s primárními protilátkami proti CB1 a CB2 zředěnými 1 : 300, resp. 1 : 200 ve fosfátovém pufru (PBS) podle pokynů výrobce. Poté byly řezy inkubovány při pokojové teplotě s biotinylovaným spojovacím činidlem (Biocare Medical) po dobu 10 min, následovala inkubace s peroxidázou konjugovanou značkou streptavidinu (Biocare Medical) po dobu 10 min. Výsledná imunitní peroxidázová aktivita byla vyvolána pomocí soupravy substrátu DAB (Vector Laboratories, Kalifornie, USA) po dobu 10 min. Řezy byly protibarveny Harrisovým hematoxylinem a zamontovány do Entellanu (Merck, Darmstadt, Německo). Vhodné negativní kontroly byly provedeny vynecháním primární protilátky a/nebo její náhradou irelevantním antisérem. Jako pozitivní kontrola byly použity řezy tkání dlaždicobuněčného karcinomu prsu a mobilního jazyka se známou expresí CB1 a CB2. Proliferační schopnost folikulárních buněk byla hodnocena pomocí imunohistochemické exprese Ki-67, jak bylo popsáno dříve .

2.3. Hodnocení imunohistochemie

Imunohistochemické hodnocení bylo provedeno spočítáním nejméně 1000 nádorových buněk v každém případě dvěma nezávislými pozorovateli (Stamatios Theocharis a Paraskevi Alexandrou) zaslepenými vůči klinickým údajům, s úplnou shodou pozorovatelů. Vzorky byly považovány za „pozitivní“ na CB1 a CB2, pokud bylo pozitivně obarveno více než 5 % nádorových buněk v řezu . Imunoreaktivita nádorových buněk pro CB1 a CB2 byla hodnocena podle procenta pozitivních nádorových buněk CB1 a CB2 jako 0: negativní barvení – 0-4 % pozitivních nádorových buněk; 1: 5-24 % pozitivních nádorových buněk; 2: 25-49 % pozitivních nádorových buněk; 3: 50-100 % pozitivních nádorových buněk a její intenzita jako 0: negativní barvení, 1: mírné barvení; 2: střední barvení; 3: intenzivní barvení . Nakonec byla exprese CB1 a CB2 klasifikována jako nízká, pokud bylo celkové skóre 0 nebo 2, a vysoká a pokud bylo celkové skóre ≥3 . Imunoreaktivita Ki-67 byla klasifikována podle procenta pozitivně zbarvených folikulárních buněk, které přesáhlo střední procentuální hodnotu, do dvou kategorií (pod a nad střední hodnotu), jak bylo uvedeno dříve .

2.4. Statistická analýza

Chi-kvadrát testy byly použity k posouzení rozdílu exprese CB1 a CB2 mezi maligními a benigními lézemi štítné žlázy a také mezi případy papilárního karcinomu a hyperplastických uzlů. Chí-kvadrát testy byly použity k posouzení souvislostí mezi expresí CB1 a CB2 a klinicko-patologickými charakteristikami v podskupině pacientů s maligními lézemi štítné žlázy. Za statisticky významnou byla považována hodnota 2-tailed. Statistické analýzy byly provedeny pomocí softwarového balíku SPSS for Windows (verze 13.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

3. Výsledky

3.1. Výsledky

3.2. Výsledky

3.3. Výsledky

3.4. Klinický význam exprese CB1 u lidských maligních a benigních lézí štítné žlázy

Pozitivita CB1 (skóre IHC > 0) byla zaznamenána u 52 (60 %) z 87 lézí štítné žlázy. Třicet jedna (36 %) z 87 vyšetřovaných případů vykazovalo vysokou imunoreaktivitu CB1 (skóre IHC ≥ 3). Subcelulární vzorec distribuce CB1 byl převážně cytoplazmatický a příležitostně membránový. Normální okolní oblasti sousedící s nádorem byly shledány negativními pro CB1. Reprezentativní imunobarvení CB1 pro hyperplastický uzlík a papilární karcinom jsou znázorněny na obrázcích 1(a) a 1(b). Imunoreaktivita CB1 se významně lišila mezi benigními a maligními lézemi štítné žlázy (tabulka 1, ). Vysoká exprese CB1 byla významně častěji pozorována u papilárního karcinomu ve srovnání s hyperplastickými uzly (tabulka 1, ). Exprese CB1 nesouvisela s věkem a pohlavím pacientů a proliferační kapacitou folikulárních buněk. V podskupině maligních lézí štítné žlázy byla vysoká exprese CB1 zaznamenána ve 23 (52 %) ze 44 případů. Nebyla zjištěna souvislost mezi expresí receptoru CB1 a velikostí nádoru, přítomností kapsulární, vaskulární nebo lymfatické invaze, metastázami v lymfatických uzlinách a proliferační schopností folikulárních buněk (tabulka 2). Exprese receptoru CB1 nesouvisela s rizikem recidivy odhadovaným podle stagingového systému ATA (údaje nejsou uvedeny).

(a)

(b)

(c)

(d)

.

(a)
(b)
(c)
(d)

3.2 Imunoznačení CB2 v (c) hyperplastickém nodulu a (d) papilárním karcinomu (původní zvětšení ×200). Klinický význam exprese CB2 v lidských maligních a benigních lézích štítné žlázy

Pozitivita CB2 (skóre IHC > 0) byla zaznamenána u 61 (71 %) z 87 lézí štítné žlázy. Třicet dva (37 %) z 87 vyšetřovaných případů vykazovalo vysokou imunoreaktivitu CB2 (skóre IHC ≥ 3). Subcelulární vzorec distribuce byl převážně cytoplazmatický a příležitostně membránový. Normální okolní oblasti sousedící s nádorem byly shledány negativními pro CB2. Reprezentativní imunobarvení CB2 pro hyperplastické uzliny a papilární karcinom jsou zobrazeny na obrázcích 1c) a 1d). Vysoká exprese CB2 byla významně častěji pozorována u maligních lézí štítné žlázy ve srovnání s benigními, stejně jako u papilárního karcinomu ve srovnání s hyperplastickými uzly (tabulka 1, resp. ,). V podskupině maligních lézí štítné žlázy byla vysoká exprese CB2 zaznamenána ve 24 (55 %) ze 44 případů. Vysoká exprese CB2 byla významně spojena s přítomností metastáz v lymfatických uzlinách (tabulka 2, ). Vysoká exprese CB2 byla rovněž spojena s přítomností kapsulární, lymfatické a vaskulární invaze, avšak na nesignifikantní úrovni (tabulka 2, , a , resp. ). Nebyly zaznamenány žádné souvislosti mezi expresí CB2 a věkem a pohlavím pacientů, velikostí nádoru a mírou proliferace folikulárních buněk (tabulka 2). Vysoká exprese receptorů CB2 byla častěji pozorována u maligních lézí štítné žlázy představujících zvýšené riziko míry recidivy podle stagingového systému ATA, avšak na nesignifikantní úrovni ().

4. Diskuse

V této studii byla exprese proteinů CB1 a CB2 zvýšena u maligních lézí štítné žlázy ve srovnání s benigními. Poprvé jsme také popsali souvislost mezi expresí proteinů CB2 a klinicko-patologickými parametry, které jsou rozhodující pro léčbu a prognózu pacientů. Pozoruhodné je, že zvýšená exprese CB2 byla významně spojena s přítomností metastáz v lymfatických uzlinách a hraničně s přítomností vaskulární invaze, zatímco byly zaznamenány také orientační, ale nevýznamné asociace s přítomností kapsulární a lymfatické invaze a odhadovanou mírou recidivy. Podobné výsledky pro nadměrnou expresi receptoru CB1 byly získány, pokud jde o maligní ve srovnání s benigními lézemi štítné žlázy; nicméně byla zaznamenána nesignifikantní asociace nebo trend korelace mezi expresí CB1 a klinicko-patologickými parametry.

V souladu se současnými zjištěními byly receptory CB upregulovány u některých nádorových lidských malignit, včetně dlaždicobuněčného karcinomu ústní dutiny, karcinomu slinivky břišní, hepatocelulárního karcinomu a karcinomu prostaty, zatímco nebyly exprimovány v normálních tkáních těchto orgánů . Na druhé straně byl receptor CB1 downregulován u kolorektálního karcinomu na rozdíl od přilehlých normálních tkání, což poukazuje na rozdílné role ECS u různých nádorů a naznačuje mnohočetné interakce mezi ECS a mechanismy, které řídí růst a proliferaci buněk . Tyto mechanismy mohou zahrnovat přímou indukci smrti transformovaných buněk, zástavu buněčného cyklu a inhibici nádorové angiogeneze a metastazování . Protinádorové účinky ECS byly rovněž znázorněny v mnoha studiích. U kolorektálního karcinomu byly endokanabinoidy a syntetické kanabinoidy schopny indukovat apoptózu a inhibovat karcinogenezi prostřednictvím mechanismů zahrnujících jak receptory CB, tak kanály TRPV1 a dráhu PPARγ . K podobným výsledkům došlo i ve studiích provedených u karcinomu pankreatu, plic a prsu, cholangiokarcinomu a hepatocelulárního karcinomu . Byly rovněž zaznamenány synergické účinky kanabinoidů s konvenční protinádorovou chemoterapií .

Nedávno byla zaznamenána nadměrná exprese receptorůCB u karcinomu štítné žlázy, a to in vitro . Přesněji řečeno, stimulace IL-12 buněčných linií anaplastického karcinomu štítné žlázy indukovala nadměrnou expresi receptoru CB2 a vedla k apoptóze a regresi nádoru zprostředkované CB2-agonisty . Navíc upregulace CB2 učinila nádorové buňky citlivějšími k léčbě standardní chemoterapií . Jedním z předpokládaných vysvětlení tohoto jevu byla na ceramidech závislá aktivace mitochondriální intrinsické dráhy, která vede k apoptóze, spuštěná aktivací receptoru CB2 . Jiná studie na buněčných liniích karcinomu štítné žlázy znázornila, že 2-methyl-2′-F-anandamid (Met-F-AEA) inhiboval růst nádoru, což souviselo s vysokou hladinou receptoru CB1 . Hojná exprese receptoru CB1 byla zaznamenána u buněčných linií citlivějších na léčbu, které byly následně citlivější na inhibici růstu. Tyto výsledky byly přisuzovány aktivaci, zvýšení p53 a snížení cyklinu A, což vedlo k apoptóze .

Kromě možných terapeutických důsledků týkajících se tumorigeneze a ECS může mít detekce nadměrné exprese CB receptorů potenciál jako prognostický ukazatel. Upregulace obou receptorů CB ve vzorcích tkáně hepatocelulárního karcinomu byla významně spojena s lepší prognózou a delším přežitím bez onemocnění . Tato zjištění byla kombinována s histopatologickými charakteristikami nádoru, neboť vysoké hladiny CB receptorů byly pozorovány v případech vykazujících dobrou diferenciaci a omezené postižení portálního řečiště . Na druhé straně byla imunoreaktivita CB2 spojena s kratším přežitím bez onemocnění u dlaždicobuněčného karcinomu hlavy a krku . Pokud jde o receptor CB1, jeho nadměrná exprese byla spojena se špatným výsledkem léčby pacientů u kolorektálního karcinomu, karcinomu prostaty a karcinomu pankreatu . Zejména zvýšená exprese CB1 u pacientů s kolorektálním karcinomem ve stadiu IV nezávisle korelovala se špatnou prognózou . Zvýšená exprese CB1 byla také spojena s agresivním adenokarcinomem prostaty vykazujícím vyšší Gleasonovo skóre, větší velikost nádoru a zvýšenou míru buněčné proliferace, jakož i s metastázami v době diagnózy . Nízká exprese CB1 nebo vysoké hladiny FAAH/MAGL navíc korelovaly s delší dobou přežití a vyšším stavem bolesti. Podobné, ale ne statisticky významné výsledky byly zaznamenány pro receptor CB2 . S ohledem na výše uvedené údaje se v současnosti dostupné studie týkající se hladin receptorů CB a jejich souvislostí s prognózou u různých nádorů zdají být rozporuplné a mohou úzce souviset s mírou účasti ECS v tumorigenezi.

5 . Závěr

Zvýšené hladiny imunohistochemické exprese receptorů CB1 a CB2 korelovaly s malignitou štítné žlázy. Zvýšené hladiny exprese CB2 navíc souvisely s klinicko-patologickými charakteristikami důležitými pro terapeutický management pacientů. Tyto výsledky podpořily důkazy, že CB receptory a zejména CB2 receptor mohou zasahovat do molekulárních drah podílejících se na maligní transformaci štítné žlázy a mohly by být považovány za potenciální terapeutické cíle k potlačení progrese nádoru. Důrazně se doporučují rozsáhlejší kohortové studie s cílem potvrdit a stanovit klinickou užitečnost CB receptorů jako potenciálních prognostických markerů u neoplazie štítné žlázy.

Konflikt zájmů

Všichni autoři potvrzují, že nepřijali žádné finanční prostředky ani podporu od organizace, která by mohla jakýmkoli způsobem finančně získat nebo ztratit z výsledků této studie. Všichni autoři ověřují, že nebyli zaměstnáni v organizaci, která může jakýmkoli způsobem finančně získat nebo ztratit z výsledků této studie. Žádný z autorů není v jiném střetu zájmů.

Příspěvek autorů

Eleftheria Lakiotaki a Constantinos Giaginis se na studii podíleli rovným dílem.

.