Identifikace a charakterizace nového botulinum neurotoxinu

Prohledávání genomických databází odhalilo nový gen BoNT

Ve snaze prozkoumat evoluční krajinu BoNT jsme provedli iterativní prohledávání databáze sekvencí Uniprot pomocí skrytého Markovova modelu. Naše vyhledávání identifikovalo všechny známé podtypy BoNT a mozaikové toxiny, jakož i příbuzný tetanový neurotoxin (obr. 1a; doplňkový obr. 1). K našemu překvapení vyhledávání odhalilo potenciálně nový BoNT, předběžně označený jako BoNT/X (obr. 1a, číslo GenBank: BAQ12790.1), z nedávno oznámené genomové sekvence kmene 111 C. botulinum. BoNT/X vykazoval při párovém porovnávání nejmenší identitu proteinových sekvencí s ostatními BoNT (obr. 1b). Nízká sekvenční podobnost je navíc rovnoměrně rozložena podél celé sekvence BoNT/X (obr. 1c), což naznačuje, že se nejedná o mozaikový toxin. Navzdory této nízké sekvenční identitě je u BoNT/X zachováno celkové uspořádání domén BoNT (obr. 1c), včetně zinkově závislého proteázového motivu HEXXH (zbytky 227-231, HELVH) v LC (cit.33 ) a motivu SXWY v HC (zbytky 1 274-1 277, SAWY), který rozpoznává lipidové receptory gangliosidy34.

(a) Síť fylogenetického rozdělení zahrnující všechny sérotypy BoNT, subtypy, mozaikové toxiny a příbuzný tetanový neurotoxin (TeNT) znázorňuje jejich potenciální evoluční vztahy a také konflikty vyplývající např. z chimérismů na základě jejich proteinových sekvencí. BoNT/X je zvýrazněn červeně. Zvětšená verze tohoto panelu je uvedena na doplňkovém obr. 1 s vyznačeným přístupovým číslem sekvence pro každý gen toxinu. (b) Fylogenní strom zarovnání proteinových sekvencí pro BoNT/A-G, TeNT a BoNT/X, analyzovaný metodou ClustalW. Jsou zaznamenána procenta sekvenční identity mezi jednotlivými toxiny a BoNT/X. (c) Horní panel: schematický nákres tří domén BoNT/X s vyznačeným konzervovaným proteázovým motivem v LC a gangliosidovým vazebným motivem v HC. Dolní panel: Analýza pomocí posuvného okna pro porovnávání sekvencí ukázala, že nízká podobnost mezi BoNT/X a ostatními BoNT/TeNT je rovnoměrně rozložena podél celé sekvence BoNT/X. Osa X představuje polohu dotazované sekvence ve středu 100aminokyselinového pohyblivého okna pro porovnávání sekvencí. Osa Y ukazuje procento identity mezi tímto sekvenčním oknem a každou ze zarovnaných sekvencí pozadí. Dva sloupce v horní části grafu znázorňují nejlepší shodnou sekvenci (spodní sloupec) a to, zda je nejlepší shoda významně oddělena od druhé nejlepší shody (horní sloupec). (d) Schematický nákres shluku genů orf, který hostí gen BoNT/X (horní panel), který má dva odlišné rysy ve srovnání s jinými známými shluky orfX (střední a dolní panel): (1) vedle genu BoNT/X se nachází další protein orfX2 (označený orfX2b); (2) čtecí rámec genů orfX má stejný směr jako gen BoNT/X.

Podobně jako ostatní BoNT se gen BoNT/X nachází v genovém klastru23. Všech sedm zavedených BoNT je exprimováno společně s dalším 150 kDa proteinem známým jako NTNHA (netoxický nehemaglutininový protein), který tvoří s BoNT komplex závislý na pH a chrání je před proteázami v gastrointestinálním traktu35. Genu BoNT/X předchází také potenciální gen NTNHA (obr. 1d). Kromě BoNT a NTNHA obsahuje typický genový klastr BoNT geny kódující jeden ze dvou typů akcesorních proteinů: (1) klastr HA kódující tři konzervované proteiny HA17, HA33 a HA70, které tvoří komplex s BoNT/NTNHA a usnadňují vstřebávání toxinů přes střevní epiteliální bariéru36,37,38; nebo (2) klastr OrfX kódující konzervované proteiny OrfX1, OrfX2, OrfX3 a P47 s neznámou funkcí23 . Gen BoNT/X se nachází v genovém klastru OrfX, stejně jako BoNT/E, F a členové BoNT/A. Zajímavé je, že klastr BoNT/X má dvě jedinečné vlastnosti (obr. 1d): (1) existuje další gen OrfX2, který se nevyskytuje v žádném jiném shluku BoNT (označili jsme ho OrfX2b); (2) čtecí rámec genů OrfX je obvykle opačný než u genů BoNT/NTNHA, ale má stejný směr jako gen BoNT/X ve shluku BoNT/X (obr. 1d). Tato zjištění naznačují, že BoNT/X je jedinečnou větví rodiny BoNT.

LC BoNT/X štěpí VAMP2 na novém místě

Pro charakterizaci BoNT/X jsme se nejprve zaměřili na jeho LC (X-LC, zbytky 1-439) a vyrobili jej jako protein značený His6 v Escherichia coli. Jako kontroly byly paralelně vyrobeny a testovány LC BoNT/A (A-LC) a BoNT/B (B-LC). Inkubace X-LC s detergentními extrakty z mozku potkana (BDE) neovlivnila syntaxin 1 ani SNAP-25, ale zrušila imunoblotové signály VAMP2 (obr. 2a). LC BoNT jsou proteázy závislé na zinku33. Podle očekávání EDTA zabránila štěpení proteinů SNARE pomocí X-, A- a B-LC (obr. 2a). Kromě toho inkubace X-LC s purifikovanou rekombinantní cytosolickou doménou VAMP2 (zbytky 1-93) přeměnila VAMP2 na dva pásy s nižší molekulovou hmotností (obr. 2b), což potvrzuje, že X-LC štěpí VAMP2.

(a) X-LC byl inkubován s BDE. Byla provedena imunoblotová analýza pro detekci syntaxinu 1, SNAP-25 a VAMP2. Synaptofyzin (Syp) sloužil jako kontrola zatížení. A-LC a B-LC byly analyzovány paralelně. Štěpení VAMP2 pomocí B-LC vede ke ztrátě imunoblotových signálů, zatímco štěpení SNAP-25 pomocí A-LC vytváří menší fragment (označený hvězdičkou). EDTA blokovala aktivitu X-, A- a B-LC. (b) VAMP2 (1-93) byl inkubován s X-LC. Vzorky byly analyzovány pomocí SDS-PAGE a barvení Coomassie Blue. X-LC přeměnila VAMP2 (1-93) na dva menší fragmenty. (c-e) VAMP2 (1-93) byl inkubován s X-LC. Vzorky byly analyzovány hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) za účelem stanovení molekulové hmotnosti štěpených fragmentů. Eluované peptidové píky z kolony HPLC jsou vyneseny v závislosti na době běhu (RT, osa X). Údaje hmotnostní spektrometrie pro dva produkty štěpení jsou barevně označeny a je zaznamenán poměr hmotnosti a náboje (m/z). Molekulová hmotnost je odvozena vynásobením m se z a následným odečtením z. Sekvence proteinů pro oba štěpné produkty jsou barevně označeny a uvedeny v c. (f) Zarovnání sekvencí mezi členy rodiny VAMP, přičemž místa štěpení pro BoNT/B, D, F, G a X jsou označena červeně a dva motivy SNARE modrým odstínem. (g) VAMP1, 3, 7 a 8 značené HA a Sec22b a Ykt6 značené Myc byly exprimovány v buňkách 293T pomocí transientní transfekce. Buněčné lyzáty byly inkubovány s X-LC a podrobeny imunoblotové analýze. Jako kontrola zatížení slouží aktin. (h) Ykt6 značený GST byl inkubován s X-LC (100 nM). Vzorky byly analyzovány pomocí SDS-PAGE a barvení Coomassie Blue. (i) VAMP2 (33-86), VAMP4 (1-115) a VAMP5 (1-70) značené GST byly inkubovány s X-LC (100 nM). Vzorky byly analyzovány pomocí SDS-PAGE a barvení Coomassie Blue. X-LC štěpila VAMP4 i VAMP5. Poznamenáváme, že protein VAMP5 obsahuje kontaminující pás, který probíhá v blízkosti štěpného produktu. (j) Experimenty byly provedeny stejně jako v bodě a s tím rozdílem, že byly detekovány VAMP4 a Sec22b. Synaptotagmin I (Syt I) je kontrola zatížení. X-LC štěpí nativní VAMP4 v BDE. Je zobrazen jeden ze dvou (b,g,j) nebo tří (a,h,i) nezávislých experimentů.

Pro identifikaci místa štěpení jsme analyzovali protein VAMP2 (1-93), s preinkubací s X-LC nebo bez ní, pomocí kapalinové chromatografie-tandemové hmotnostní spektrometrie (LC-MS/MS, obr. 2c-e). Po inkubaci s X-LC se objevil jediný dominantní peptidový pík (obr. 2c,e; doplňkový obr. 2). Jeho molekulová hmotnost je 3 081,7, což odpovídá pouze peptidové sekvenci A67-L93 VAMP2 (obr. 2c,e). Shodně byl detekován i další fragment od začátku His6-značky po zbytek R66 VAMP2 (obr. 2d). Pro další potvrzení tohoto zjištění jsme test zopakovali s jiným fragmentem VAMP2: VAMP2 značeným glutathion S-transferázou (GST) (33-86) (doplňkový obr. 3). Inkubace s X-LC vytvořila jediný dominantní pík peptidu o molekulové hmotnosti 2 063,1, který odpovídá pouze A67-R86 VAMP2 (doplňkový obr. 3). Tyto výsledky společně ukazují, že X-LC má jediné štěpné místo na VAMP2 mezi R66 a A67.

R66-A67 je nové štěpné místo na VAMP2, odlišné od všech zavedených cílových míst BoNT (obr. 2f). Je to také jediné štěpné místo BoNT, které se nachází v oblasti dříve známé jako motiv SNARE (obr. 2f, stínované oblasti)39. Rodina proteinů VAMP zahrnuje proteiny VAMP1, 2, 3, 4, 5, 7 a 8, jakož i příbuzné Sec22b a Ykt6. R66-A67 je konzervován u VAMP1 a 3, které jsou vysoce homologní s VAMP2. Pro ověření specifity X-LC jsme exprimovali HA-značené VAMP1, 3, 7, 8 a Myc-značené Sec22b a Ykt6 v buňkách HEK293 pomocí transientní transfekce. Buněčné lyzáty byly inkubovány s X-LC. VAMP1 i 3 byly štěpeny pomocí X-LC, zatímco VAMP7, VAMP8 a Sec22b byly vůči X-LC rezistentní (obr. 2g).

BoNT/X štěpí VAMP4, VAMP5 a Ykt6

Neočekávaně byl pomocí X-LC štěpen také Ykt6 (obr. 2g). Toto zjištění bylo potvrzeno pomocí purifikovaného fragmentu Ykt6 značeného GST, který se po inkubaci s X-LC posunul do pásma s nižší molekulovou hmotností (obr. 2h). Místo štěpení bylo určeno jako K173-S174 pomocí hmotnostně spektrometrické analýzy intaktního Ykt6 a Ykt6 štěpeného pomocí X-LC (doplňkový obr. 4). Toto místo je homologní s místem štěpení BoNT/X na VAMP2 (obr. 2f). Z rodiny proteinů VAMP obsahuje VAMP4 v tomto místě stejný pár zbytků (K87-S88) jako Ykt6. Zjistili jsme, že X-LC štěpí jak purifikovanou cytoplazmatickou doménu VAMP4 značenou GST (obr. 2i), tak nativní VAMP4 v BDE (obr. 2j). Jako kontrola nebyl Sec22b štěpen pomocí X-LC v BDE. Kromě toho byla štěpena také cytoplazmatická doména VAMP5 značená GST (obr. 2i). Místa štěpení byla určena hmotnostně spektrometrickou analýzou jako K87-S88 u VAMP4 a R40-S41 u VAMP5 (doplňkový obr. 5). Obě místa jsou homologní s místem štěpení BoNT/X na VAMP2 (obr. 2f), což dokazuje, že umístění místa štěpení je konzervováno napříč různými VAMP. Schopnost X-LC štěpit VAMP4, VAMP5 a Ykt6 je velmi neobvyklá, protože jejich sekvence se od VAMP1/2/3 podstatně liší. BoNT/X je první a jediný známý BoNT, který dokáže štěpit VAMP mimo kanonické cíle VAMP1, 2 a 3 (ref. 40).

Proteolytická aktivace BoNT/X

Dále jsme zkoumali linkerovou oblast mezi LC a HC, která musí být štěpena bakteriálními nebo hostitelskými proteázami, aby se toxin převedl na „aktivní“ dvouřetězcovou formu. Vytvořili jsme rekombinantní fragment X-LC-HN (zbytky 1-891) v E. coli a podrobili jej omezené proteolýze endoproteinázou Lys-C. Vzorky byly analyzovány pomocí tandemového hmotnostního značení (TMT) a tandemové hmotnostní spektrometrie. TMT značí volné N-konce (a lyziny). Omezená proteolýza Lys-C vytvořila jeden nový volný N-konec mapovaný na zbytek N439 v oblasti linkeru (obr. 3a; doplňková data 1), což potvrzuje, že oblast linkeru je citlivá na proteázy.

(a) Sekvenční zarovnání linkeru mezi LC a HC sedmi zavedených BoNT plus BoNT/X. Řezné místo Lys-C bylo identifikováno analýzou hmotnostní spektrometrie (viz metoda a doplňková data 1). (b) Kultivované krysí kortikální neurony byly vystaveny působení X-LC-HN po dobu 12 h. Byly odebrány buněčné lyzáty a provedena imunoblotová analýza za účelem vyšetření syntaxinu 1, SNAP-25 a VAMP2. Jako kontrola zatížení slouží aktin. Trypsinem aktivovaná A-LC-HN a B-LC-HN byly analyzovány paralelně. X-LC-HN vstoupila do neuronů a štěpila VAMP2. X-LC-HN aktivovaná Lys-C vykazovala větší účinnost než neaktivovaná X-LC-HN. X-LC-HN byl účinnější než B-LC-HN a A-LC-HN, z nichž ani jeden neštěpil své substráty. (c) WT a mutantní X-LC-HN byly aktivovány Lys-C a analyzovány pomocí SDS-PAGE a barvení Coomassieho modří, s DTT nebo bez něj. Mutanty C461S a C467S se ukázaly jako jeden pás o ∼100 kDa bez DTT a s DTT se rozdělily na dva pásy o ∼50 kDa. Část WT X-LC-HN tvořila agregáty označené hvězdičkou, které s DTT zmizely. Většina aktivovaného WT X-LC-HN se bez DTT oddělila do dvou pásů ∼50 kDa. To je způsobeno promícháním disulfidových vazeb, jak je popsáno na následujícím panelu. (d) Lys-C aktivovaná WT X-LC-HN byla inkubována s NEM, aby se zablokovalo promíchání disulfidových vazeb. Vzorky byly poté analyzovány pomocí SDS-PAGE a barvení Coomassieho modří. Většina WT X-LC-HN existuje jako jediný pás při ∼100 kDa bez DTT po ošetření NEM, což naznačuje, že nativní WT X-LC-HN obsahuje meziřetězcovou disulfidovou vazbu. (e) Schematické nákresy disulfidové vazby u WT a tří cysteinových mutant BoNT/X. (f) Experimenty byly provedeny stejně, jak je popsáno v bodě b, s tím rozdílem, že neurony byly vystaveny působení WT nebo mutantů X-LC-HN. Mutace C423S zrušila aktivitu X-LC-HN, zatímco mutace C461 nebo C467 neměla na aktivitu X-LC-HN vliv. Tyto výsledky potvrdily, že meziřetězcová disulfidová vazba je nezbytná pro aktivitu X-LC-HN a že tato meziřetězcová disulfidová vazba může být vytvořena buď prostřednictvím C423-C461, nebo C423-C467. Je zobrazen jeden ze dvou (b) nebo tří (b,c,f) nezávislých experimentů.

Poté jsme zkoumali, zda proteolytická aktivace zvyšuje účinnost BoNT/X. Bylo prokázáno, že inkubace vysokých koncentrací LC-HN BoNT s kultivovanými neurony vede ke vstupu LC-HN, pravděpodobně prostřednictvím nespecifického vychytávání do neuronů41. Podobně X-LC-HN vstoupil do kultivovaných potkaních kortikálních neuronů a štěpil VAMP2 v závislosti na koncentraci (obr. 3b). Aktivace pomocí Lys-C zvýšila účinnost X-LC-HN: 10 nM aktivovaného X-LC-HN štěpilo podobné množství VAMP2 jako 150 nM intaktního X-LC-HN (obr. 3b). Aktivovaná X-LC-HN se zdá být účinnější než aktivované LC-HN BoNT/A (A-LC-HN) a BoNT/B (B-LC-HN), které za stejných podmínek testu nevykazovaly žádné detekovatelné štěpení svých substrátů (obr. 3b).

Disulfidová vazba mezi řetězci v BoNT/X

Stejně jako u ostatních BoNT obsahuje linkerová oblast BoNT/X dva konzervované cysteiny, ale je zde také další cystein (C461), který je pro BoNT/X jedinečný (obr. 3a). Abychom určili cysteinové zbytky, které tvoří nezbytnou meziřetězcovou disulfidovou vazbu, vytvořili jsme tři mutanty X-LC-HN, každý s mutací jednoho ze tří cysteinových zbytků (C423S, C461S a C467S). Tyto mutanty, stejně jako X-LC-HN divokého typu (WT), byly podrobeny omezené proteolýze pomocí Lys-C a poté analyzovány pomocí SDS-PAGE a barvení Coomassieho modří s redukčním činidlem dithiothreitolem (DTT) nebo bez něj; obr. 3c. Očekává se, že mutace jediného cysteinu na LC (C423S) zruší disulfidovou vazbu mezi řetězci. V souladu s tím se mutant C423S bez DTT oddělil na dva pásy ∼50 kDa. Naproti tomu mutanty C461S i C467S se v nepřítomnosti DTT projevily jako jeden pás o velikosti 100 kDa a v přítomnosti DTT se rozdělily na dva pásy o velikosti ∼50 kDa. Tyto výsledky naznačují, že C423 na LC může tvořit meziřetězcovou disulfidickou vazbu s C461 nebo C467 na HC. Zjistili jsme také, že působením Lys-C došlo k degradaci významné části mutantu C423S ve srovnání s mutanty C461S nebo C467S (obr. 3c, +DTT), což naznačuje, že ztráta meziřetězcové disulfidické vazby činí molekulu náchylnější k působení proteáz. Všimli jsme si, že část WT X-LC-HN tvořila agregáty v horní části SDS-PAGE gelu (obr. 3c, označeno hvězdičkou). Tyto agregáty zmizely v přítomnosti DTT. C423/C461/C467 jsou jediné tři cysteiny v X-LC-HN; mutace kteréhokoli z nich zrušila tvorbu agregátů (obr. 3c, -DTT), což naznačuje, že tyto agregáty jsou tvořeny mezimolekulárními disulfidickými vazbami v důsledku existence dalšího cysteinu v linkerové oblasti.

Zajímavé je, že většina aktivovaných WT X-LC-HN se bez DTT oddělila do dvou pásů ∼50 kDa (obr. 3c), což je podobné jako u mutanty C423S. Na druhou stranu WT X-LC-HN nevykazoval zvýšenou degradaci Lys-C ve srovnání s mutantem C423S (obr. 3c, +DTT). Jedním z možných vysvětlení je, že WT X-LC-HN obsahuje za nativních podmínek meziřetězcovou disulfidickou vazbu, která se však za denaturačních podmínek v SDS pufru může přeskupit na vnitrořetězcovou dvojici C461-C467. Tento jev je znám jako promíchání disulfidických vazeb, ke kterému často dochází mezi sousedními cysteiny. K ověření této hypotézy jsme použili alkylační činidlo, N-etylmaleimid (NEM), které trvale blokuje volné cysteiny a zabraňuje promíchání disulfidických vazeb. Jak ukazuje obr. 3d, WT X-LC-HN předem ošetřená NEM se v nepřítomnosti DTT projevila jako jediný pás o velikosti 100 kDa a v přítomnosti DTT se rozdělila na dva pásy o velikosti ∼50 kDa. Tyto výsledky potvrzují, že WT X-LC-HN obsahuje převážně meziřetězcovou disulfidickou vazbu, ale je náchylný k promíchání disulfidické vazby v důsledku extra cysteinu v linkerové oblasti (obr. 3e).

Dále jsme zkoumali aktivitu tří cysteinových mutant X-LC-HN na kultivovaných neuronech. Podle očekávání byl mutant C423S neaktivní, zatímco mutanty C461S a C467S vykazovaly podobnou úroveň aktivity jako WT X-LC-HN (obr. 3f). Tyto výsledky potvrzují, že disulfidová vazba mezi řetězci je pro aktivitu BoNT/X kritická.

Vytvoření BoNT/X plné délky pomocí ligování zprostředkovaného sortázou

Poté jsme se snažili zjistit, zda je BoNT/X plné délky funkční toxin. Jelikož nejsou k dispozici žádná antiséra proti BoNT/X, rozhodli jsme se vyhnout generování aktivního toxinového genu plné délky. Místo toho jsme vyvinuli přístup k vytvoření omezeného množství BoNT plné délky ve zkumavkách enzymatickou ligací dvou netoxických fragmentů BoNT. Tato metoda využívá transpeptidasu známou jako sortasa42,43, která rozpoznává peptidový motiv LPXTG, štěpí ho mezi T-G a současně vytváří novou peptidovou vazbu s jinými proteiny/peptidy obsahujícími N-terminální glycin (obr. 4a). Vytvořili jsme dva netoxické fragmenty BoNT/X: (1) LC-HN s motivem LPETGG a značkou His6 sloučenou s C-koncem a (2) HC BoNT/X (X-HC) se značkou GST, místem štěpení trombinem a dalším glycinovým zbytkem na N-konci. Řezáním trombinem se uvolní X-HC s volným glycinem na N-konci. Inkubace těchto dvou fragmentů se sortázou vytvořila malé množství ∼150 kD BoNT/X plné délky (X-FL, obr. 4a,b). Poznamenáváme, že X-HC vykazoval špatnou rozpustnost a silnou tendenci k agregaci, což může být důvodem nízké účinnosti ligace (obr. 4b). Naproti tomu ligace X-LC-HN s HC BoNT/A (A-HC) dosáhla lepší účinnosti, přičemž většina X-LC-HN byla ligována do chimérického toxinu XA (doplňkový obr. 6a). Pro zajištění biologické bezpečnosti je množství prekurzorových fragmentů v reakci přísně omezeno, aby vzniklo minimální množství ligovaného toxinu potřebné pro funkční testy.

(a) Schematický nákres metody ligování sortázy. (b) Směsi sortázové ligační reakce byly analyzovány pomocí SDS-PAGE a barvení Coomassieho modří. Hvězdička označuje agregáty proteinů způsobené mezimolekulárními disulfidovými vazbami. Plně dlouhý BoNT/X (X-FL) se objevil pouze v sortázové ligační směsi. (c) Neurony vystavené působení sortázové ligační směsi (15 μl) nebo kontrolní směsi po dobu 12 hodin v kultivačním médiu. Buněčné lyzáty byly analyzovány pomocí imunoblotu. Směs obsahující X-LC-HN i X-HC (ale ne sortázu) štěpila o něco více VAMP2 než samotná X-LC-HN. Ligace X-LC-HN a X-HC sortázou dále zvýšila štěpení VAMP2, což dokazuje, že ligovaný X-FL je na neuronech funkční. (d) BoNT/A-G, BoNT/DC a BoNT/X byly podrobeny testu dot blot s použitím čtyř koňských antisér (trivalentní anti-BoNT/A, B a E, anti-BoNT/C, anti-BoNT/DC a anti-BoNT/F) a dvou kozích antisér (anti-BoNT/G a anti-BoNT/D). BoNT/X se skládá z X-LC-HN a X-HC v molárním poměru 1:1. Tato antiséra rozpoznala odpovídající cílové toxiny, avšak žádné z nich nerozpoznalo BoNT/X. Antiséra proti BoNT/DC a BoNT/C reagují křížově, protože tyto dva toxiny mají vysoký stupeň podobnosti v rámci svých HC domén. (e) Kultivované krysí kortikální neurony byly vystaveny ligovanému X-FL v kultivačním médiu po dobu 12 hodin, a to se dvěma kombinacemi antisér nebo bez nich. Ab1: trivalentní anti-BoNT/A/B/E, anti-BoNT/C a anti-BoNT/F. Ab2: anti-BoNT/G a anti-BoNT/D. Trivalentní anti-BoNT/A/B/E byla použita v ředění 1:50. Všechna ostatní antiséra byla použita v ředění 1:100. Žádné z antisér neovlivnilo štěpení VAMP2 a VAMP4 pomocí X-FL. Specifičnost a účinnost těchto antisér byla ověřena z hlediska jejich schopnosti neutralizovat cílové sérotypy ve stejném testu, jak je popsáno na doplňkovém obrázku 7. (f) X-FL spojený sortázovou reakcí (0,5 μg) byl injikován do svalů gastrocnemius pravé zadní končetiny myší (n=4). U injikované končetiny se vyvinula typická ochablá paralýza a prsty se neroztáhly během 12 h. Levé končetině nebyly toxiny injikovány a sloužila jako kontrola. (g) Plná délka neaktivní formy BoNT/X (BoNT/XRY) byla purifikována jako rekombinantní protein označený His6 v E. coli. Další purifikovaný BoNT/XRY je zobrazen na doplňkovém obr. 8b. Je zobrazen jeden ze dvou (e) nebo tří (c,d) nezávislých experimentů.

Nejprve jsme analyzovali aktivitu ligovaného BoNT/X pomocí kultivovaných potkaních kortikálních neuronů. Neurony byly vystaveny ligované směsi sortázy a kontrolní směsi v kultivačním médiu. Jak ukazuje obr. 4c, samotná X-LC-HN štěpila část VAMP2 vzhledem k její vysoké koncentraci v reakční směsi. Smíchání X-HC s X-LC-HN bez sortázy mírně zvýšilo štěpení VAMP2 ve srovnání se samotným X-LC-HN, což naznačuje, že X-HC může být spojen s X-LC-HN prostřednictvím nekovalentních interakcí. Tato interakce se zdá být specifická, protože smíchání A-HC s X-LC-HN nezvýšilo štěpení VAMP2 v neuronech (doplňkový obr. 6b). Ligace X-LC-HN s X-HC pomocí sortázy jasně zvýšila štěpení VAMP2 ve srovnání se směsí X-LC-HN a X-HC bez sortázy (obr. 4c). Tyto výsledky prokázaly, že X-HC je funkční pro cílení buněk a že ligovaný BoNT/X plné délky vstoupil do neuronů a štěpil VAMP2. Podobně i ligovaná XA vstoupila do neuronů a štěpila VAMP2 (doplňkový obr. 6b).

BoNT/X nebyl rozpoznán antiséry proti známým BoNT

Dále jsme provedli dot blot testy s použitím antisér vznesených proti známým BoNT, včetně všech sedmi sérotypů i jednoho mozaikového toxinu (BoNT/DC), abychom potvrdili, že BoNT/X je sérologicky jedinečný. Byla použita čtyři koňská antiséra (trivalentní anti-BoNT/A, B a E, anti-BoNT/C, anti-BoNT/DC a anti-BoNT/F) a dvě kozí antiséra (anti-BoNT/G a anti-BoNT/D). Specifičnost a účinnost těchto antisér byla nejprve ověřena analýzou jejich schopnosti neutralizovat BoNTs na kultivovaných neuronech. Podle očekávání všechna antiséra neutralizovala své cílové BoNTs, aniž by ovlivnila aktivitu jiného sérotypu (doplňkový obr. 7). Zjistili jsme, že tato antiséra rozpoznala odpovídající BoNT v testu dot blot, avšak žádné z nich nerozpoznalo BoNT/X (obr. 4d).

Dále jsme analyzovali, zda lze toxicitu BoNT/X na neuronech těmito antiséry neutralizovat. X-FL vytvořený ligací zprostředkovanou sortázou byl nejprve aktivován omezenou proteolýzou pomocí trypsinu. K aktivaci X-FL jsme použili trypsin místo Lys-C pro funkční testy, protože trypsin nám umožňuje zastavit proteolýzu pomocí inhibitorů trypsinu. Aktivovaný X-FL vstoupil do kultivovaných potkaních kortikálních neuronů a štěpil VAMP2 i VAMP4 v závislosti na koncentraci (obr. 4e). Kombinace antisér proti známým BoNT (Ab1 (koňská antiséra): trivalentní anti-BoNT/A, B a E, anti-BoNT/C a anti-BoNT/F; Ab2 (kozí antiséra): anti-BoNT/G a anti-BoNT/D) neovlivnily aktivitu ligovaného X-FL, o čemž svědčí podobné stupně štěpení VAMP2 a VAMP4 v přítomnosti těchto antisér (obr. 4e). Tyto výsledky potvrdily, že BoNT/X je nový sérotyp BoNT.

BoNT/X vyvolal ochablou paralýzu in vivo u myší

Dále jsme se snažili určit, zda je BoNT/X aktivní in vivo pomocí dobře zavedeného neletálního testu u myší, známého jako test Digit Abduction Score (DAS), který měří lokální svalovou paralýzu po injekci BoNT do svalů zadních končetin myší44. BoNTs způsobují ochablou paralýzu končetinových svalů, která se projevuje jako neschopnost roztáhnout prsty v reakci na úlek. Do svalů gastrocnemius pravé zadní končetiny myší jsme injikovali ligovaný X-FL (0,5 μg, aktivovaný trypsinem), který vyvolal typickou ochablou paralýzu a neroztáhnutí prstů (obr. 4f), což naznačuje, že BoNT/X je schopen způsobit ochablou paralýzu in vivo. Poznamenáváme, že účinnost ligovaného X-FL se v tomto testu zdá být mnohem nižší než u jiných BoNT. Abychom dále potvrdili nízkou toxicitu ligovaného X-FL, injikovali jsme myším 1 μg ligovaného X-FL intraperitoneálně (n=3). U žádné myši se neprojevily systémové účinky a všechny myši při této dávce přežily. Ligovaný X-FL má tedy poměrně nízkou toxicitu in vivo u myší ve srovnání s jinými nativními BoNT, jejichž smrtelné dávky se obvykle pohybují na nízkých pikogramových hodnotách na myš.

Plně neaktivní BoNT/X

Nakonec jsme vyvinuli neaktivního mutanta BoNT/X jako potenciální činidlo pro tvorbu neutralizačních protilátek. Mutace na dvou zbytcích (R362A/Y365F) v BoNT/A inaktivují proteázovou aktivitu LC a ruší toxicitu BoNT/A in vivo45,46 . Tato dvě rezidua jsou zachována v BoNT/X. Zavedli jsme odpovídající mutace (R360A/Y363F) do BoNT/X a vytvořili jsme inaktivní formu plné délky, označenou jako BoNT/XRY. Jak ukazuje obr. 4g, BoNT/XRY byl purifikován jako protein značený His6 v E. coli a neměl žádnou aktivitu na kultivovaných neuronech (doplňkový obr. 8a). Kromě toho intraperitoneální injekce 30 μg BoNT/XRY (aktivovaného trypsinem) myším nezpůsobila žádné nežádoucí účinky (n=5), což dokazuje, že není toxický in vivo. Značná část BoNT/XRY tvořila agregáty v horní části SDS-PAGE gelu (obr. 4g). Přidáním DTT se tyto agregáty zredukovaly na monomerní BoNT/XRY (obr. 4g). BoNT/X plné délky je tedy náchylný k tvorbě mezimolekulárních disulfidických vazeb. Nicméně monomerní formu BoNT/X lze purifikovat a je stabilní v roztoku (obr. 4g). Dále jsme vyvinuli purifikační protokol, který umožnil získat BoNT/XRY s výtěžkem ∼3 mg na litr kultury a čistotou ∼90 % (doplňkový obr. 8b). Vysoce přečištěný BoNT/XRY zůstal stabilní v roztoku až do 10 mg ml-1 v přítomnosti redukčního činidla. Tento atoxický BoNT/XRY bude cenným činidlem pro tvorbu neutralizačních protilátek.

.