Hollidayova spojka

Dvě cesty homologní rekombinace u eukaryot, znázorňující vznik a řešení Hollidayových spojů

Hollidayova spojka je klíčovým mezistupněm homologní rekombinace, biologického procesu, který zvyšuje genetickou rozmanitost přesunem genů mezi dvěma chromozomy, a také místně specifických rekombinačních událostí za účasti integras. Kromě toho se podílejí na opravách dvouřetězcových zlomů. Kromě toho mohou vznikat křížové struktury zahrnující Hollidayovy spoje, které uvolňují šroubovicové napětí v symetrických sekvencích v superzávitech DNA. Čtyřramenné křižovatky se sice objevují také ve funkčních molekulách RNA, jako je spliceosomální RNA U1 a vlásenkový ribozym viru tabákové kroužkovitosti, ale ty obvykle obsahují nepárové nukleotidy mezi párovými dvoušroubovicovými doménami, a proto striktně nepřijímají Hollidayovu strukturu.

Hollidayovy křižovatky při homologní rekombinaci jsou mezi identickými nebo téměř identickými sekvencemi, což vede k symetrickému uspořádání sekvencí kolem centrální křižovatky. To umožňuje, aby docházelo k procesu migrace větví, při němž se vlákna pohybují přes místo spoje. Ke štěpení nebo rozlišení Hollidayova spoje může dojít dvěma způsoby. Štěpení původní sady vláken vede ke vzniku dvou molekul, které mohou vykazovat genovou konverzi, ale ne chromozomální crossover, zatímco štěpení druhé sady dvou vláken způsobí, že výsledné rekombinantní molekuly vykazují crossover. Všechny produkty bez ohledu na štěpení jsou heteroduplexy v oblasti migrace Hollidayova spoje.

Mnoho proteinů je schopno rozpoznat nebo narušit strukturu Hollidayova spoje. Jedna taková třída obsahuje enzymy řešící junkce, které štěpí junkce, někdy sekvenčně specifickým způsobem. Takové proteiny narušují strukturu spoje různými způsoby, často stahují spoj do nesestavené konformace, rozbíjejí centrální páry bází a/nebo mění úhly mezi čtyřmi rameny. Dalšími třídami jsou proteiny migrace větví, které zvyšují rychlost výměny o řády, a rekombinázy specifické pro dané místo. U prokaryot se resolvátory Hollidayových spojů dělí na dvě rodiny, integrázy a nukleázy, které jsou si strukturně podobné, i když jejich sekvence nejsou konzervovány.

U eukaryot existují dva základní modely toho, jak homologní rekombinace opravuje dvouřetězcové zlomy v DNA: cesta opravy dvouřetězcových zlomů (DSBR) (někdy nazývaná model dvojitého Hollidayova spoje) a cesta žíhání řetězce závislého na syntéze (SDSA). V případě dvouřetězcového zlomu je 3′ konec degradován a delší 5′ konec zasahuje do sousední sesterské chromatidy a vytváří replikační bublinu. Jakmile se tato bublina přiblíží k přerušené DNA, delší 5′ antisense vlákno opět napadne sense vlákno této části DNA a přepisuje druhou kopii. Když replikace skončí, oba chvosty se znovu spojí a vytvoří dva Hollidayovy spoje, které jsou pak různými způsoby štěpeny proteiny. Animaci tohoto procesu si můžete prohlédnout zde.

Dvouřetězcové zlomy DNA jsou u bakterií opravovány cestou homologní rekombinace RecBCD. Předpokládá se, že zlomy, které se vyskytují pouze na jednom ze dvou vláken DNA, tzv. jednovláknové mezery, jsou opravovány cestou RecF. Jak cesta RecBCD, tak cesta RecF zahrnují sérii reakcí známých jako migrace větví, při níž dochází k výměně jednoho vlákna DNA mezi dvěma zkříženými molekulami duplexní DNA, a rezoluce, při níž jsou tyto dvě zkřížené molekuly DNA od sebe odděleny a obnoveny do normálního dvouvláknového stavu. Homologní rekombinace se vyskytuje u několika skupin virů. U DNA virů, jako je herpesvirus, dochází k rekombinaci mechanismem break-and-rejoin podobně jako u bakterií a eukaryot. U bakterií migraci větví usnadňuje komplex RuvABC nebo protein RecG, molekulární motory, které k pohybu spoje využívají energii hydrolýzy ATP. Spojení se pak musí rozdělit na dva samostatné duplexy a obnovit buď rodičovskou konfiguraci, nebo zkříženou konfiguraci. Rozlišení může při homologní rekombinaci probíhat buď horizontálně, nebo vertikálně, čímž vznikají produkty typu patch (pokud jsou při opravě dvouřetězcových zlomů ve stejné orientaci) nebo produkty typu splice (pokud jsou při opravě dvouřetězcových zlomů v různých orientacích). RuvA a RuvB jsou proteiny pro migraci větví, zatímco RuvC je enzym řešící spoje.

Existují důkazy o rekombinaci u některých RNA virů, konkrétně u virů s pozitivním smyslem ssRNA, jako jsou retroviry, pikornaviry a koronaviry. O tom, zda dochází k homologní rekombinaci u negativních ssRNA virů, jako je chřipka, se vedou spory.

RozlišeníUpravit

U poupat kvasinek Saccharomyces cerevisiae lze Hollidayovy spoje řešit čtyřmi různými cestami, které v podstatě odpovídají za veškeré řešení Hollidayových spojů in vivo. Dráha, která vytváří většinu crossoverů u poupat kvasinek S. cerevisiae a pravděpodobně i u savců, zahrnuje proteiny EXO1, heterodimer MLH1-MLH3 (nazývaný MutL gamma) a SGS1 (ortolog helikázy Bloomova syndromu). Heterodimer MLH1-MLH3 se přednostně váže na Hollidayovy spoje. Jedná se o endonukleázu, která vytváří jednořetězcové zlomy v superzávitové dvouřetězcové DNA. Heterodimer MLH1-MLH3 podporuje tvorbu crossover rekombinantů. Zatímco ostatní tři cesty, na nichž se podílejí proteiny MUS81-MMS4, SLX1 a YEN1, mohou podporovat řešení Hollidayových spojů in vivo, nepřítomnost všech tří nukleáz má na tvorbu produktů crossoveru jen mírný vliv.

Dvojité mutanty s odstraněnou MLH3 (hlavní dráha) i MMS4 (vedlejší dráha) vykazovaly dramaticky snížený crossing over ve srovnání s divokým typem (6 až 17krát); životaschopnost spor však byla poměrně vysoká (62 %) a chromozomální disjunkce se zdála být většinou funkční.

Ačkoli je MUS81 součástí minoritní crossoverové dráhy v meióze pučících kvasinek, rostlin a obratlovců, u prvoka Tetrahymena thermophila je MUS81 zřejmě součástí esenciální, ne-li dominantní crossoverové dráhy. Dráha MUS81 se zdá být také převládající křížící dráhou u štěpných kvasinek Schizosaccharomyces pombe.

Bílkoviny MSH4 a MSH5 tvoří u kvasinek a lidí heterooligomerní strukturu (heterodimer). U kvasinky Saccharomyces cerevisiae působí MSH4 a MSH5 specificky na usnadnění křížení mezi homologními chromozomy během meiózy. Komplex MSH4/MSH5 váže a stabilizuje dvojité Hollidayovy spoje a podporuje jejich rozdělení na produkty crossoveru. Hypomorfní (částečně funkční) mutant MSH4 u S. cerevisiae vykazoval 30% snížení počtu křížení v celém genomu a velký počet meióz s nevýměnnými chromozomy. Přesto tento mutant poskytl vzorce životaschopnosti spor, které naznačují, že k segregaci nevýměnných chromozomů dochází účinně. U S. cerevisiae tedy správná segregace zřejmě nezávisí zcela na křížení mezi homologními páry

.