Articles / 24 září, 2021

Histomorfologická kritéria kostní dřeně mohou přesně diagnostikovat hemofagocytární lymfohistiocytózu

Hemofagocytární lymfohistiocytóza (HLH) je vzácné multisystémové zánětlivé onemocnění, jehož diagnostická kritéria vycházejí ze studie HLH-2004. Jediným histomorfologickým kritériem je hemofagocytóza, která však sama o sobě není pro diagnózu HLH ani specifická, ani senzitivní. Zatímco objektivní prahové hodnoty pro klinická a laboratorní kritéria byly stanoveny, specifická kritéria pro histomorfologický průkaz hemofagocytózy u HLH nebyla důsledně vyhodnocena ani stanovena. Snažili jsme se zjistit, zda lze stanovit číselná a objektivní kritéria pro morfologickou hemofagocytózu a zda by tato kritéria pomohla při diagnostice HLH. Analyzovali jsme morfologické znaky hemofagocytózy u 78 pacientů s klinickými příznaky podezřelými z HLH: 40 pacientů s HLH a 38 pacientů bez HLH. Prokázali jsme, že samotná nenukleární erytrofagocytóza je nespecifickým nálezem, zatímco hemofagocytóza granulocytů , nukleárních erytrocytů (4 na 1000 buněk, AUC: 0,92, 95%CI: 0,87, 0,98) a alespoň jednoho hemofagocytu obsahujícího více nukleárních buněk (AUC: 0,91, 95%CI: 0,85, 0,95) je silně spojena s HLH. Společné modelování hemofagocytů obsahujících pohlcené granulocyty, jádrové erytrocyty a lymfocyty účinně rozlišilo mezi HLH a non-HLH (křížově ověřená AUC: 0,90, 95%CI: 0,83, 0,97).

Úvod

Hemofagocytární lymfohistiocytóza (HLH) je vzácný život ohrožující syndrom, který vzniká sekundárně v důsledku závažné systémové imunitní aktivace.1 Cytotoxická proliferace T-buněk vede ke zvýšené produkci cytokinů a aktivaci makrofágů sídlících ve tkáních. V konečném důsledku může poškození více koncových orgánů způsobené masivním zánětem vést bez včasné diagnózy a zahájení vhodné léčby k fatálnímu výsledku.2

Hemofagocytární lymfohistiocytóza postihuje pacienty všech věkových kategorií a vyskytuje se jako dědičné onemocnění nebo sekundárně v souvislosti s predisponujícími stavy, které mění normální imunitní odpověď. Dědičná forma onemocnění se projevuje v raném dětství a je spojena s homozygotními mutacemi v genech podílejících se na imunitě zprostředkované CD8 T-buňkami a NK-buňkami.3 Tyto genetické formy HLH jsou bez transplantace krvetvorných buněk nebo genové terapie shodně smrtelné. Sekundární HLH se může sporadicky vyskytnout u zdravých jedinců, ale častěji se s ní setkáváme u pacientů s hematologickou malignitou, autoimunitním onemocněním a iatrogenní imunosupresí. Předpokládá se, že prakticky všechny případy vyžadují infekční nebo neinfekční spouštěč, který iniciuje aberantní imunitní odpověď, bez ohledu na základní imunitní dysfunkci.74

Hemofagocytární lymfohistiocytóza se projevuje náhle v průběhu několika dnů až týdnů s konzistentním obrazem horečky, pancytopenie a splenomegalie. Mezi běžné laboratorní abnormality patří hyperferitinemie, hypofibrinogenemie, hypertriglyceridemie, zvýšený solubilní IL-2 receptor a abnormální jaterní funkční testy.1 Nejpoužívanější diagnostická kritéria pro HLH byla vyvinuta pro zařazení do studie HLH-2004, která vyžaduje genetický důkaz mutace spojené s HLH nebo splnění 5 z 8 klinických kritérií, včetně horečky, splenomegalie, bicytopenie, hypertriglyceridemie nebo hypofibrinogenemie, důkazu hemofagocytózy v kostní dřeni nebo jiných tkáních, nízké nebo chybějící aktivity NK buněk, zvýšeného feritinu a zvýšeného solubilního receptoru IL-2.3 Ačkoli tato kritéria HLH-2004 nebyla validována pro dospělé, mají široké uplatnění u pacientů všech věkových kategorií.

Patologové hrají zásadní roli při diagnostickém vyšetření pacientů s podezřením na HLH. Vyšetření kostní dřeně se provádí za účelem posouzení hemofagocytózy, identifikace základní malignity a vyloučení benigních nebo neoplastických mimikrů. Přítomnost hemofagocytózy v kostní dřeni splňuje jedno z diagnostických kritérií HLH-2004; nebyla však stanovena žádná přijatelná diagnostická hranice ani pokyny pro hlášení. Nedostatek pokynů založených na důkazech vede ke značné nejistotě mezi patology ohledně toho, jaký stupeň hemofagocytózy je dostatečný pro splnění tohoto kritéria. K tomuto problému přispívá i skutečnost, že hemofagocytóza není specifická pro diagnózu HLH, pokud nejsou přítomny další klinické příznaky onemocnění. Vzácná erytrofagocytóza je běžně pozorována v aspirátech kostní dřeně a se zvýšenou hemofagocytózou se lze setkat při sepsi, krevních transfuzích, transplantaci krvetvorných buněk, chemoterapii a myelodysplastickém syndromu.118

Vzhledem k tomu, že neexistuje definovaná hranice pro splnění kritéria pro diagnózu HLH, navrhli jsme tuto retrospektivní studii s cílem zjistit, zda kvantitativní nebo kvalitativní morfologické znaky hemofagocytózy v aspirátech kostní dřeně předpovídají případnou diagnózu HLH. Identifikovali jsme skupinu pacientů s klinickými charakteristikami, které vzbuzovaly obavy z HLH, a jejich aspiráty byly vyšetřeny naslepo.

Hemofagocyty byly spočítány na 1000 jaderných buněk podle linie jejich požitého krvetvorného obsahu (obrázek 1). Kromě kvantitativních znaků jsme hodnotili binární morfologický znak, přítomnost více jaderných buněk v rámci jednoho hemofagocytu, jako možný prediktivní znak HLH.

Metody

Výběr pacientů

V databázi Laboratory Information Service pro patologii (Powerpath) jsme vyhledávali pomocí následujících klíčových slov: „hemofagocytární lymfohistiocytóza“, „hemofagocytóza“, „erytrofagocytóza“ a „HLH“. Toto vyhledávání vrátilo 258 výsledků mezi daty 1. ledna 2013 a 7. ledna 2017 a zahrnovalo text odkudkoli z diagnostické zprávy včetně uvedených klinických informací, mikroskopického popisu, diagnostické linie a/nebo diagnostického komentáře (obrázek 2). Zdravotní záznamy těchto pacientů byly přezkoumány EG s cílem posoudit, zda bylo v době aspirace kostní dřeně přítomno klinické podezření na HLH, a to buď uvedené na formuláři žádosti o vzorek (tj. „vyloučit HLH“ nebo „obavy z HLH“), nebo uvedené v diferenciální diagnóze v elektronické zdravotnické dokumentaci (EMR) během jednoho týdne před biopsií. U každého pacienta byly shromážděny demografické informace, klinické charakteristiky, diagnostické dojmy, patologické znaky a laboratorní hodnoty v době biopsie. Pacienti byli klasifikováni jako „HLH“ a „non-HLH“ na základě diagnostického dojmu konzultujících hematologů popsaného v klinických záznamech. Konečná diagnóza byla ve všech případech stanovena na základě kritérií HLH-2004 ve spojení s celkovým klinickým obrazem. Pacienti byli z analýzy vyloučeni, pokud byla hemofagocytóza zaznamenána náhodně nezávisle na klinických obavách z HLH, pokud nebyly k dispozici preparáty k přezkoumání, pokud se uvažovalo o HLH, ale diagnóza byla po vyšetření nejednoznačná, nebo pokud byla před biopsií zaznamenána dokumentovaná anamnéza léčby zaměřené na HLH. Tato studie byla schválena institucionální revizní komisí Stanfordovy univerzity.

Vyhodnocení aspirátů kostní dřeně

Aspiráty kostní dřeně (obarvené podle Wright-Giemsy) pacientů s HLH a bez HLH byly hodnoceny zaslepeně. Každé sklíčko aspirátu bylo nejprve vyšetřeno při nízkém výkonu (4x), aby bylo možné identifikovat oblasti s hemofagocytózou a vybrat vhodné sklíčko pro sčítání hemofagocytů. V oblastech s nejvyšší hustotou hemofagocytů bylo v každém kvadrantu na jednom aspirátu pro každý případ spočítáno dvě stě padesát intaktních jaderných buněk. Histiocyty byly sečteny podle linie požitých buněk (zralé RBC, nRBCS, granulocyty a lymfocyty) a součet hematopoetických progenitorových buněk (HPC) byl vypočten jako celkový počet histiocytů obsahujících požité hematopoetické buňky. Zaznamenána byla také přítomnost více jaderných buněk v jednom hemofagocytu.

Metody použité pro statistickou analýzu jsou popsány v online doplňkové příloze.

Výsledky

Charakteristiky pacientů

Charakteristiky pacientů 40 pacientů s HLH a 38 pacientů bez HLH jsou shrnuty v tabulce 1. V tabulce 1 je uveden přehled pacientů s HLH. Nebyly zjištěny žádné významné rozdíly ve věku nebo pohlaví. U pacientů s HLH se častěji vyskytovala základní malignita ve srovnání se skupinou bez HLH (56 % vs. 24 %; P<0,05), přičemž nejčastější primární diagnózou u pacientů s HLH byl difuzní velkobuněčný B-lymfom (DLBCL) (tabulky 1 a 2). Virus Epsteina-Barrové (EBV) byl nejčastějším infekčním spouštěčem identifikovaným u pacientů s HLH; 32,5 % pacientů ve skupině s HLH mělo průkaz infekce EBV pomocí detekce PCR v periferní krvi nebo imunohistochemie ve srovnání s 10 %.5 % ve skupině bez HLH (P<0,01).

Podle očekávání měli pacienti s diagnózou HLH častěji klinické a laboratorní nálezy splňující jednotlivá diagnostická kritéria HLH-2004 (tabulka 1). Mezi skupinami s HLH a bez HLH byly pozorovány významné rozdíly v průměrných hodnotách jednotlivých laboratorních testů (triglyceridy, fibrinogen, feritin a rozpustný IL-2r) a v počtu pacientů splňujících každé jednotlivé kritérium HLH-2004, s výjimkou funkce přirozených zabíječů (NK). Ačkoli se zhoršená nebo chybějící funkce NK-buněk považuje za platný screeningový nástroj pro pacienty s genetickými defekty cytotoxicity, tento test se u dospělých se sekundární HLH objednává zřídka a má vysokou míru selhání, což omezuje jeho diagnostickou užitečnost.

Hemofagocytóza byla zaznamenána v diagnostické zprávě kostní dřeně všech 40 pacientů s HLH ve srovnání s 12 z 38 (32 %) ve skupině bez HLH (P<0,01). Ačkoli průkaz hemofagocytózy může být pro lékaře při stanovení diagnózy HLH uklidňující, hemofagocytóza není nutná. V našem souboru většina pacientů, u kterých byla nakonec diagnostikována HLH (73 %), splňovala 5 nebo více kritérií nezávisle na průkazu hemofagocytózy v aspirátu kostní dřeně (tabulka 1). Nicméně 9 pacientů (23 %) ve skupině s HLH a 8 pacientů (21 %) ve skupině bez HLH splňovalo 4 kritéria s vyloučením hemofagocytózy, což naznačuje, že morfologické posouzení aspirátu kostní dřeně bylo rozhodující pro diagnózu u 22 % pacientů, u nichž se objevily klinické příznaky vzbuzující obavy z HLH.

Dva pacienti ve skupině HLH splňovali méně než 5 kritérií HLH-2004; oba tito pacienti však byli chirurgicky aspleničtí a zbytek jejich klinických a laboratorních nálezů, včetně přítomnosti hemofagocytózy v aspirátu kostní dřeně, byl slučitelný s diagnózou. Čtyři pacienti ve skupině bez HLH splňovali 5 kritérií, ale HLH u nich nebyla diagnostikována. Z klinických poznámek ošetřujících lékařů vyplývá, že chronicita příznaků byla považována za neslučitelnou s HLH. U žádného z těchto pacientů nebyla v kostní dřeni zjištěna hemofagocytóza.

Vývoj prediktivních modelů pro morfologickou diagnózu hemofagocytární lymfohistiocytózy

Pacienti s diagnózou HLH (n=40) vykazovali významně vyšší hodnoty celkových hemofagocytů a hemofagocytů s některou z buněčných linií (RBC, nRBC, granulocyty a lymfocyty) ve srovnání s pacienty bez HLH (n=38) (P<0.001 pro všechny linie) (obrázky 1 a 3). Korelační analýza prokázala, že každé z klinických a laboratorních kritérií zahrnutých do kritérií HLH-2004 (s výjimkou funkce NK) má významnou pozitivní korelaci s celkovým počtem hemofagocytů a hemofagocytů s každou z jednotlivých buněčných linií, což naznačuje, že stupeň hemofagocytózy koreluje s diagnózou HLH (online doplňkový obrázek S1).

Nezávisle na sobě jednotlivé linie poměrně dobře rozlišovaly mezi HLH a non-HLH. Nejvyšší plochu pod křivkou (AUC) měly požité nRBC a požité granulocyty, což svědčí o vysokém stupni správné klasifikace subjektů s HLH a non-HLH (AUC: 0,92), přičemž prahové hodnoty byly 2 požité buňky, resp. 1 požitá buňka. Součet všech čtyř linií také dobře rozlišoval mezi HLH a non-HLH s prahovou hodnotou 6 (AUC: 0,92, 95%CI: 0,85, 0,98).

Dichotomizací jednotlivých linií na základě výše popsaných prahových hodnot a zahrnutím všech čtyř do rozhodovacího stromu byly jako nejdůležitější prediktor HLH vybrány hemofagocyty požírající granulocyty, následované nRBC a lymfocyty (obr. 4A). Pacienti s absencí hemofagocytů požírajících granulocyty měli 3% šanci na diagnózu HLH. U pacientů s přítomností alespoň jednoho hemofagocytu s pozřeným granulocytem, dvou nebo více hemofagocytů s pozřenými nRBC a jednoho hemofagocytu s pozřenými lymfocyty dohromady byla zaručena diagnóza HLH (100% šance). Křížově ověřená (CV) AUC tohoto CART byla 0,90; 95%CI: 0,83-0,97.

Identifikace lymfocytů v rámci HPC je vzácná, a to i v přítomnosti floridní HLH. Nejvyšší počet HPC obsahujících lymfocyty byl identifikován u pacienta s DLBCL a na základě morfologie pravděpodobně představoval pozřené nádorové buňky. Kromě toho je rozlišení mezi jádrovými erytrocyty, lymfocyty a hematopoetickými progenitorovými buňkami v cytoplazmě histiocytu náročné a podléhá interpretační variabilitě. Proto jsme vytvořili další CART s vyloučením lymfocytů. Tento CART je totožný s prvními dvěma úrovněmi předchozího modelu, přičemž pacienti mají 92% pravděpodobnost diagnózy HLH s přítomností alespoň jednoho hemofagocytu s požitým granulocytem a dvou nebo více hemofagocytů s požitými nRBC (obrázek 4B). Zatímco CV AUC byla totožná s první, celková přesnost byla mírně vyšší u CART bez lymfocytů (88% CV přesnost vs. 86%).

Kvalitativní hodnocení

Původní popis hemofagocytárního syndromu spojeného s viry popisoval histiocyty, které byly „naplněny“ pozřenými krvetvornými elementy.11 U pacientů s prokázanou HLH jsme často pozorovali fenomén mnohočetných jaderných buněk uvnitř jednotlivých histiocytů a předpokládali jsme, že tento nález může svědčit o patologickém hemofagocytárním stavu. Abychom zhodnotili význam stupně hemofagocytózy uvnitř jednotlivých hemofagocytů, analyzovali jsme přítomnost mnohočetných jaderných buněk uvnitř histiocytů (obrázek 1). Naše analýza nakonec ukázala, že alespoň jeden hemofagocyt obsahující více jaderných buněk byl identifikován u 37 pacientů s HLH ve srovnání s pouhými 4 pacienty ve skupině bez HLH (AUC: 0,91, 0,845-0,947), což naznačuje, že tento binární kvalitativní znak funguje podobně jako výše popsané kvantitativní metriky pro odlišení pacientů s HLH od pacientů bez HLH (tabulka 3).

Diskuse

Vzhledem k vzácnosti diagnózy a nespecifickému klinickému obrazu je HLH pro kliniky a patology náročnou diagnózou. Po zvážení diferenciální diagnózy se běžně provádí účelné vyšetření zahrnující vyhodnocení každého z kritérií HLH-2004, protože včasný terapeutický zásah zlepšuje výsledky u těchto často kriticky nemocných pacientů. Bohužel neexistuje žádná definovaná hranice pro splnění diagnostického kritéria hemofagocytózy v kostní dřeni a nebyly stanoveny pokyny založené na důkazech pro hlášení nálezů.

Pro tento cíl jsme navrhli tuto retrospektivní studii, abychom zjistili, zda kvantitativní znaky hemofagocytózy v době počátečního hodnocení kostní dřeně předpovídají konečnou diagnózu HLH u pacientů, kteří se dostavili s klinickými znaky týkajícími se této diagnózy. Vzhledem k tomu, že HLH se klasicky projevuje multilineární cytopenií, o níž se předpokládá, že je výsledkem konzumace hematopoetických buněk aktivovanými makrofágy12 , předpokládali jsme, že pacienti s HLH budou s větší pravděpodobností vykazovat hemofagocytózu jádrových erytrocytů, granulocytů a lymfocytů ve srovnání s pacienty bez HLH. Kromě hodnocení možných kvantitativních rozdílů v hemofagocytóze jsme současně hodnotili přítomnost více jaderných buněk v rámci jednoho hemofagocytu jako kandidáta na binární morfologický znak, který může odlišit pacienty s patologickou hemofagocytózou.

Obecně jsme zjistili, že pacienti s HLH vykazovali významně vyšší počet HPC podle každé ze zkoumaných linií (tabulka 3). Identifikovali jsme také kvantitativní prahové hodnoty, které lze použít k přesné diagnostice většiny případů HLH: jeden granulocyt nebo dvě jádrové erytroidní buňky na 1000 jaderných buněk. Kromě toho jsme využili analýzu klasifikačního a regresního stromu k identifikaci nejlepší kombinace proměnných pro vytvoření ještě specifičtějšího a prediktivnějšího modelu pro rozlišení pacientů s HLH. Nakonec jsme ukázali, že přítomnost více jaderných buněk v rámci jednoho hemofagocytu byla navíc prediktivní pro diagnózu HLH u pacientů s klinickým nálezem, který vzbuzoval obavy z tohoto onemocnění.

Původní popis hemofagocytárního syndromu spojeného s viry (VAHS) popisoval floridní hemofagocytózu v 19 případech imunosuprimovaných a dříve zdravých pacientů, u kterých se objevily klinické příznaky slučitelné s HLH.11 V 60 po sobě jdoucích aspirátech kostní dřeně použitých pro srovnání zjistili erytrofagocytózu ve 29 z 60 případů; stupeň fagocytózy však „nikdy nebyl takového stupně, aby se dal zaměnit s VAHS“. Tato studie provedená před vypracováním kritérií HLH-2004 poskytla první důkaz o souvislosti hemofagocytózy s VAHS (což bychom nyní nazvali HLH) a ukázala, že nález erytrofagocytózy je často identifikován v aspirátech kostní dřeně pacientů bez HLH, což ukazuje na nedostatečnou specifičnost při izolaci klinických nálezů.

Provedli jsme podobné nezaslepené hodnocení 87 aspirátů kostní dřeně od pacientů s de novo a po léčbě myeloidních a lymfoidních malignit, benigních cytopenií a negativních stagingových dření a identifikovali jsme převážně erytrofagocytózu zralých RBC v 39 % těchto případů. Při použití kvantitativního prahu stanoveného na základě naší analýzy pro pohlcené nejaderné RBC (erytrofagocyty) na tento soubor dat jsme zjistili, že pouze 3 z 87 pacientů (5 %) by splňovali toto morfologické kritérium (4 na 1000 buněk). Podobně pokud použijeme kvantitativní práh pro granulocyty (1 na 1000 buněk), pouze 4 z 87 pacientů (4 %) by splňovali toto morfologické kritérium. Ačkoli tedy skutečně můžeme nalézt vzácné příklady erytrofagocytózy v aspirátových nátěrech u velké menšiny případů, použití kvantitativních prahových hodnot odhaluje nízký výskyt klinicky významné hemofagocytózy v populaci pacientů, která odráží pacienty pozorované v běžné diagnostické praxi.

Nedávná studie Ho et al. zkoumala specifičnost hemofagocytózy pro HLH kvantifikací absolutního množství hemofagocytózy zjištěné v aspirátech kostní dřeně pacientů, jejichž diagnostická patologická zpráva popisovala hemofagocytózu.10 Prokázali, že přítomnost hemofagocytózy, i když je přítomna ve vysokém množství, není pro HLH dostatečně specifická. Naše institucionální zkušenost je v souladu s jejich závěrem, že významná hemofagocytóza není prediktivní pro diagnózu HLH při absenci klinických příznaků, které by vyvolávaly obavy z tohoto onemocnění; přítomnost významné hemofagocytózy je však poměrně vzácným nálezem. Incidentální hemofagocytóza byla v letech 2013-2017 zaznamenána v 86 z 8097 (1,1 %) zpráv o interní biopsii kostní dřeně ve Stanfordské univerzitní nemocnici. Většina hlášení uvádí „vzácnou“ hemofagocytózu (61 %), zatímco zbytek popisuje „roztroušenou“, „příležitostnou“ nebo „prudkou“ hemofagocytózu. Byla přezkoumána podskupina (n=12) těchto posledních případů. Všech 12 případů vykazovalo erytrofagocytózu. Polovina případů vykazovala pozřené granulocyty a 3 případy prokázaly mnohočetné jádrové buňky v rámci jednotlivých HPC. U žádného z těchto pacientů nebyla nakonec diagnostikována HLH.

Jedním z hlavních omezení této studie je její retrospektivní charakter. Náš soubor je omezen na pacienty, u nichž byla důkladně vyhodnocena klinická diagnóza a bylo definitivně rozhodnuto o diagnóze HLH. Vyloučili jsme pacienty, u nichž byla konečná diagnóza nejednoznačná. Navíc, ačkoli náš soubor zahrnuje všechny pacienty v naší instituci, kteří splňovali kritéria pro hodnocení, včetně dětí, pouze jediný pacient v našem souboru měl homozygotní mutaci diagnostikovanou jako primární HLH, což omezuje použitelnost našich výsledků na pacienty s genetickými formami onemocnění. Nakonec poznamenáváme, že ačkoli testování CD107a bylo popsáno jako citlivější test pro primární HLH,13 tento nedávno vyvinutý test nebyl v této retrospektivní kohortě využit.

Diagnostika HLH nakonec spočívá na důkladném posouzení pacientů v příslušném klinickém kontextu. Stejně tak mikroskopické vyšetření stěrů z aspirátu kostní dřeně u pacientů s podezřením na HLH vyžaduje pečlivé zhodnocení přítomnosti hemofagocytózy. Naše výsledky ukazují, že kvantitativní prahové hodnoty linie požitých buněk, ať už samostatně nebo v kombinaci, přesně předpovídají případnou diagnózu HLH. Dále prokazujeme, že identifikace jediného hemofagocytu obsahujícího ve své cytoplazmě více jádrových hematopoetických buněk funguje podobně jako náš kvantitativní přístup. Doufáme, že po externí validaci a dalším prospektivním studiu pomohou tyto údaje poskytnout patologům a klinickým lékařům metodu pro systematické hodnocení a přesnou klasifikaci pacientů s HLH a přispějí k vytvoření konsenzuálních pokynů pro diagnostiku a hlášení.

Poznámky

↵* Na této práci se rovným dílem podíleli BAM a RSO.
Nejnovější informace o tomto článku, online dodatky a informace o odhalení autorství & najdete v online verzi: www.haematologica.org/content/103/10/1635

Přijato 17. prosince 2017.
Přijato 13. června 2018.

Universe