Guanidin

Membránové proteiny

Roztoky guanidinu a SDS jsou denaturační rozpouštědla, ale my jsme samozřejmě chtěli charakterizovat i nativní stavy membránových proteinů. Potíž zde spočívala v tom, že dosud neexistovala shoda v tom, jak nativní stav definovat nebo si jej představit – což pro nováčky, jako jsme byli my, znamenalo nejistotu, protože jsme neměli takové zkušenosti, které by nám umožnily prozíravě odhadnout, která ze soupeřících představ se pravděpodobně ukáže jako správná.

Dokonce i o fosfolipidové dvojvrstvě, jediném nezbytném pojmu pro nejnutnější pochopení buněčných membrán, se stále vedly spory, přestože byla poprvé prokázána na červených krvinkách téměř před 50 lety a byla skutečně jediným myslitelným uspořádáním na základě termodynamiky, což byl přímý důsledek klasických měření Irvinga Langmuira z roku 1917 s monovrstvami amfifilních látek. Směšně pomalé přijímání konceptu dvojvrstev v mezidobí jsem popsal ve své knize Ben Franklin zastavil vlny . Jde o to, že skepse přetrvávala i v době, kdy jsme se začali zabývat výzkumem membrán.

I mezi těmi, kteří byli o lipidové dvojvrstvě přesvědčeni, se stále diskutovalo o způsobu zabudování proteinů do membrán. Někteří, jako například náš kolega z Dukeovy univerzity David Robertson, se zdráhali uvěřit, že by proteiny mohly skutečně proniknout do dvojvrstvy nebo jí projít. Dvě zcela odlišné koncepční představy, které byly pořízeny na konferenci Newyorské akademie věd v roce 1972, jsou uvedeny na obrázku 3 . Jeden z nich je Robertsonova „jednotková membrána“ s bílkovinami zcela na vnější straně. Na druhém je Vanderkooiův pohled na cytochromoxidázové komplexy v mitochondriálních membránách: protein je umístěn realističtěji, ale zatím neexistuje žádná představa o odlišných hydrofilních a hydrofobních doménách a o tom, jak by mohly diktovat interakci proteinů s lipidy. Později v témže roce 1972 se nyní konvenční idealizovaný obraz fosfolipidových dvojvrstev s fungujícími proteiny, které jimi procházejí, konečně zpopularizoval díky Singerovu a Nicolsonovu modelu „fluidní mozaiky“ .

Obr. 3. Obr. 3. Fosfolipidové dvojvrstvy. Dvě nesourodé koncepční představy o membránových proteinech, obě navržené na stejném setkání v New Yorku v roce 1972 : (a) Robertson se domníval, že proteiny budou asymetricky rozmístěny, mimo dva povrchy dvojvrstvy; (b) Vanderkooiův pohled na komplexy cytochromoxidázy v příčném řezu.

V laboratoři to byly vzrušující časy, nejvzrušivější, jaké si pamatuji. Naučili jsme se používat neškodné detergenty, které na rozdíl od SDS dokázaly rozpustit membránové proteiny bez hrubé denaturace, v prostředí simulujícím nativní stav, ale v prostředí, kde by byly také snadno přístupné pro molekulární charakterizaci – pokrok, v němž nás částečně předešli dva sympatičtí mladí muži z Finska, Kai Simons a Ari Helenius .

V praxi jsme se stále většinou omezovali na měření molekulové hmotnosti a otázky, kolik polypeptidových řetězců připadá na jednu molekulu, ale proteiny, kterých se tyto otázky týkaly, byly odděleny ošetřením detergentem od ostatních složek membrány. A co je nejdůležitější, mnoho proteinů mělo známou buněčnou funkci a naše měření se těchto funkcí týkala. Již jsem se zmínil o červených krvinkách, ale ve skutečnosti se nám podařilo pokrýt celou řadu biologicky relevantních témat, v mnoha případech povzbuzených misionářským zápalem studentů. Například postgraduální student fyziologie Stuart Grefrath se zájmem o neurofyziologii přišel do naší laboratoře, aby spočítal polypeptidové řetězce vzrušivé membrány – v tomto případě z čichového nervu garfish – a to nás vedlo k následnému zapojení do několika dalších aktivních transportních systémů. (Sám Stuart bohužel zemřel v důsledku vrozeného kardiovaskulárního onemocnění dříve, než mohl naplnit svůj raný příslib samostatné kariéry). Mozkový myelin byl další membránou z nervového systému, které jsme se věnovali .

Za zmínku stojí také dva návštěvníci laboratoře, kteří se rozhodli spolupracovat: Neal Robinson, postdoktorand, a Leon Visser, který byl na studijním volnu z CSIR v Pretorii v Jihoafrické republice). Odvedli velmi elegantní práci při kvantitativním definování doménové struktury cytochromu b5, který je jakýmsi prototypem pro ilustraci toho, jak jsou membránové proteiny připojeny k membránám a přesto plní svou funkci v přilehlé cytoplazmě .

V jiných projektech jsme reagovali na žádosti vzdálených kolegů. Již jsem se zmínil o práci s Arthurem Karlinem na acetylcholinovém receptoru z elektrické ryby. Dalším příkladem byl bakteriorhodopsin, u kterého jsme na žádost Waltera Stoeckeniuse z Kalifornské univerzity prováděli měření v detergentním roztoku . Zde vyvstala důležitá otázka související s mechanismem protonové pumpovací aktivity tohoto proteinu: je nativní protein funkčně monomer, nebo (jak se zdálo z některých údajů) jde o trimer? Náš solubilní protein byl nepochybně monomer a spektrální důkazy naznačovaly, že prochází stejným cyklem molekulárních změn jako v nativní membráně.

Ve většině případů jsme se sami přímo nezapojili do snahy rozluštit, jak receptory, pumpy nebo kanály fungují, ale nevyhnutelně jsme si uvědomili, v čem jsou problémy. Byla to skutečně obohacující zkušenost, docela rozdíl oproti dobám, kdy byly hlavním cílem našeho výzkumu sérový albumin a β-laktoglobulin (získané od komerčních dodavatelů).

V případě iontových pump jsme skutečně vstupovali do fyziologie, většinou na úrovni hypotéz nebo teorie; učili jsme se modelovat kinetická schémata pomocí počítače; účastnili jsme se příslušných konferencí atd. V tomto ohledu byl důležitý náš poslední sabatický pobyt – na Institutu Maxe Plancka v Heidelbergu. Při této příležitosti se k nám připojil vedoucí katedry fyziologie na Dukeově univerzitě Ted Johnson, takže jsme aktivně spolupracovali tři. Ted byl již dlouho počítačovým nadšencem a připojil každého jednotlivého člena fyziologické fakulty k centrálnímu počítačovému zařízení North Carolina Research Triangle dříve, než se stalo módou vynakládat tímto způsobem katedrové prostředky. V té době jsme museli psát vlastní programy pro počítač, což pro mě bylo obtížné, ale myslím, že jsme získali několik užitečných výsledků, většinou v oblasti kinetických modelů pro čerpací cyklus Na,K pumpy poháněné ATP. Pracovali jsme v nestandardní pracovní dobu, včetně víkendů a svátků, což někdy znepokojovalo naše heidelberské hostitele, kteří byli zvyklí vypínat ústřední topení, když laboratoř neměla být obsazena. Zhruba každých deset dní jsme jezdili přes hranice do Štrasburku na gurmánský oběd – doprovázený alsaskými víny, jejichž chuť jsme si od té doby vychutnávali.