Genomická diferenciace a mezikontinentální populační struktura komářích přenašečů Culex pipiens pipiens a Culex pipiens molestus

Nezávislý monofyletický původ Culex pipiens pipiens a Culex pipiens molestus

Byly navrženy dvě alternativní hypotézy vysvětlující rozdíly v ekologických a fyziologických strategiích Cx. p. pipiens a Cx. p. molestus19. Jedna hypotéza vysvětluje tuto diferenciaci jako rychlou změnu fyziologických a behaviorálních znaků jako adaptaci na podzemní prostředí, které je spojeno s lidskou činností22. Podle tohoto scénáře musí být místní populace Cx. p. molestus úzce příbuzné místním populacím Cx. p. pipiens30. Tento scénář považuje Cx. p. molestus za ekofyziologickou variantu Cx. p. pipiens. Alternativní hypotéza předpokládá, že rozdíl mezi Cx. p. pipiens a Cx. p. molestus je důsledkem odlišnosti v jejich evoluční historii. Ekologické a fyziologické strategie Cx. p. molestus mohly nejprve vzniknout v teplém klimatu19. Později se tato strategie ukázala jako relevantní kvůli lidským aktivitám, které vytvořily podzemní prostředí, a tím rozšířily Cx. p. molestus po celém světě. Tento scénář považuje Cx. p. molestus a Cx. p. pipiens za samostatné evoluční entity.

V naší studii jsme tyto hypotézy testovali pomocí analýzy celého genomu 40 vzorků Cx. p. molestus a Cx. p. pipiens získaných ze čtyř lokalit v Eurasii a Severní Americe. Naše výsledky zamítly hypotézu o opětovném vzniku Cx. p. molestus z místních populací Cx. p. pipiens a silně podpořily myšlenku nezávislého monofyletického původu Cx. p. pipiens i Cx. p. molestus z různých kontinentů. NJ a ML analýzy odděleně shlukují Cx. p. pipiens a Cx. p. molestus z Běloruské republiky, Kyrgyzské republiky a Chicaga, IL, USA (obr. 2, doplňkové obr. 1-3). Přítomnost dalšího hybridního shluku tvořeného autogenními a anautogenními terénními sběry z Washingtonu, D.C., USA spíše odráží existenci hybridní zóny Cx. pipiens – Cx. quinquefasciatus v této oblasti16. Na základě genetických vzdáleností má však tento shluk mnohem blíže k euroasijskému Cx. p. pipiens než k Cx. p. molestus z Eurasie a USA (Chicago, IL). Analýzy PCA (obr. 3) a ADMIXTURE (obr. 4) navíc identifikovaly dva odlišné genetické shluky, které odpovídají Cx. p. pipiens a Cx. p. molestus. V obou případech se všechny exempláře z Washingtonu D.C. shlukovaly společně s Cx. p. pipiens z jiných lokalit. Celogenomové párové hodnoty Fst byly vysoce signifikantní pro všechna srovnání (obr. 5). V genomu jsme neidentifikovali žádnou specifickou oblast s vysokou divergencí (obr. 6). Celkově byly hodnoty Fst mnohem vyšší mezi Cx. p. molestus a Cx. p. pipiens než mezi autogenními a anautogenními vzorky Cx. p. pipiens z Washingtonu, D.C. Nejvíce divergující skupinou na základě všech provedených analýz byl kmen Cx. p. molestus z Chicaga, IL, což lze vysvětlit velmi nízkou genetickou diverzitou tohoto kmene způsobenou jeho dlouholetou kolonizací a možným úzkým hrdlem, které urychlilo genetický drift (obr. 7).

Podobná pozorování o nezávislém monofyletickém původu Cx. p. molestus a Cx. p. pipiens byla získána pomocí mikrosatelitní analýzy u ~600 vzorků komárů Cx. pipiens pocházejících z různých světových lokalit19. Postupem nezakořeněného stromu vzdáleností byly odděleně shlukovány nadzemní populace Cx. p. pipiens a podzemní populace Cx. p. molestus ze severní a jižní Evropy. Podobně jako v naší studii vytvořily nadzemní populace Cx. p. pipiens z USA další shluk naznačující intenzivnější hybridizaci mezi členy komplexu Cx. pipiens v Severní Americe. Analýza příměsí ukázala přítomnost tří hlavních shluků, které odpovídaly Cx. p. molestus, Cx. p. pipiens a Cx. quinquefasciatus. Posledně jmenovaný shluk byl v této studii nalezen pouze ve vzorcích z USA. Jiná práce založená na analýzách polymorfismu délky amplifikovaných fragmentů (AFLP) srovnávala vzorky z jižní a severní Evropy a kmeny z Chicaga, IL, USA24. Severoamerické a evropské populace použité v této studii vykazovaly při skenování genomu pomocí AFLP podobný vzorec ADMIXTURE. Analýza genů COI rovněž naznačila monofyletický původ Cx. p. pipiens a Cx. p. molestus v Evropě, Asii a Africe26.

Nezávislý monofyletický původ a vysoká úroveň genetické divergence mezi Cx. p. molestus a Cx. p. pipiens tedy naznačují, že tito dva příslušníci rodu Cx. pipiens představují samostatné fylogenetické jednotky s nezávislou evoluční historií před translokací zprostředkovanou člověkem.

Koncepce speciace a evoluce komplexu Culex pipiens

Teoretické modely speciace u živočichů lze rozdělit do dvou hlavních skupin: alopatrická neboli geografická speciace a sympatrická neboli ekologická speciace. První pojetí speciace, které intenzivně propagoval E. Mayr3, předpokládá, že počínající taxony se nejprve geograficky izolují. Tato situace snižuje tok genů mezi populacemi a může vést ke kumulaci mutací, které způsobují genetickou inkompatibilitu mezi kříženci. Alternativní pojetí speciace zdůrazňuje ekologické bariéry mezi vznikajícími taxony jako hlavní hnací sílu evoluce31. Tento scénář uvažuje o vzniku reprodukční izolace mezi populacemi v důsledku adaptace na odlišné prostředí bez geografické izolace, která obvykle probíhá tváří v tvář toku genů. V této situaci se kříženci mezi počínajícími taxony stávají méně přizpůsobivými prostředí, které podporuje přirozený výběr všech znaků, které omezují páření mezi nimi. Domníváme se, že celková diverzifikace poddruhů Cx. p. pipiens a Cx. p. molestus představuje pozoruhodný příklad speciace prostřednictvím mechanismů izolace podle ekologie. V naší studii Fst analýza určila významné úrovně genomické divergence mezi Cx. p. pipiens a Cx. p. molestus (obr. 5 a 6) v celém genomu bez jasných ostrůvků speciace. Překvapivě byla úroveň diferenciace nižší v okolí centromer, pravděpodobně v důsledku nízkého počtu spolehlivých SNV v těchto vysoce repetitivních oblastech. Diferenciace byla extrémně vysoká mezi kmeny Cx. p. pipiens a Cx. p. molestus z Chicaga, IL, USA, ale byla nižší mezi poddruhy ve sbírkách euroasijských komárů. Celkově tato pozorování naznačují významné omezení toku genů mezi poddruhy.

Bylo popsáno několik mechanismů reprodukční izolace mezi Cx. p. pipiens a Cx. p. molestus17. Dva z nich působí prezygoticky, před oplozením, a omezují možnosti komářího páření. První mechanismus souvisí s habitatovou specializací larev: Cx. p. molestus obsazuje sklepy nebo jiná podzemní prostředí, ale Cx. p. pipiens preferuje pro rozmnožování otevřené nadzemní vodní plochy. To snižuje šance obou poddruhů na setkání a páření v dospělosti. Druhý izolační mechanismus spočívá v rozdílech v chování při páření mezi Cx. p. molestus a Cx. p. pipiens. Samci Cx. p. molestus obvykle tvoří homogenní roje u země a k páření potřebují omezený prostor17. Naproti tomu samci Cx. p. pipiens se rojí v blízkosti listí asi 2-3 m nad zemí. Experimentální studie páření v malých klecích ukázaly, že při křížení samic a samců Cx. p. molestus byla úspěšnost kopulace 90%, ale u Cx. p. pipiens pouze 3,3%32. Při mezidruhovém křížení Cx. p. molestus a Cx. p. pipiens byla úspěšnost kopulace rovněž nízká a pohybovala se mezi 6,6 % a 10 % v závislosti na pohlaví poddruhu. Tato studie prokázala, že samice obou poddruhů se aktivně vyhýbají kopulaci se samci alternativního poddruhu. Samice Cx. p. pipiens navíc neúspěšně přijímaly sperma od Cx. p. molestus a v důsledku toho neprodukovaly žádná vajíčka.

Dva další reprodukční izolační mechanismy popsané u Cx. p. pipiens a Cx. p. molestus jsou postzygotické, působí po páření a vedou ke snížení fitness hybridů. Jeden z těchto mechanismů souvisí s dědičností diapauzy u hybridů Cx. p. molestus a Cx. p. pipiens jako recesivního znaku8. F1 hybridi a značná část F2 hybridů nejsou schopni vyvinout diapauzu a nemohou přežít v zimních podmínkách. Tento mechanismus by snad mohl vysvětlit vyšší míru introgrese u Cx. p. pipiens v jižních lokalitách19,23,24. V neposlední řadě jsou členové komplexu Cx. pipiens vystaveni cytoplazmatické inkompatibilitě hybridů infikovaných různými kmeny rickettsiového parazita Wolbachia pipientis. Navzdory cytoplazmatické introgresi tohoto parazita prostřednictvím hybridizace mezi členy komplexu Cx. pipiens33 by cytoplazmatická inkompatibilita mohla výrazně omezit míru přežití hybridů. Například infekce W. pipientis výrazně omezila hybridizaci mezi Cx. pipiens a Cx. quinquefasciatus v Jižní Africe34. Jiná studie prokázala, že v euroasijských populacích byl Cx. p. molestus infikován pouze jedním kmenem W. pipientis, ale Cx. p. pipiens dvěma různými kmeny35. Navíc exempláře Cx. p. molestus a Cx. p. pipiens, které jsme použili v naší studii, byly na jihu Kyrgyzské republiky infikovány stejnými kmeny W. pipientis, ale na severu Běloruské republiky různými kmeny. Tím lze vysvětlit rozdíly v introgresi z Cx. p. molestus do Cx. p. pipiens, která byla výraznější v Běloruské republice než v Kyrgyzské republice. Zajímavý příklad infekční speciace byl ostatně popsán u jihoamerického komplexu Drosophila paulistorum. V tomto komplexu se šest polodruhů s překrývajícím se geografickým rozšířením stalo reprodukčně izolovanými v důsledku izolace před a po páření vyvolané infekcí Wolbachiae36.

Nejnovější genomické studie provedené na různých organismech včetně Drosophila simulans37, ovocných mušek Rhagoletis38,39 a motýlů Heliconius40,41 poskytují další důkazy, že v přírodě dochází k ekologické speciaci. Genomické vzorce speciace mohou být velmi rozdílné2 – od malých genomických ostrůvků speciace40 až po významné úrovně divergence v celém genomu. V komplexu An. gambiae byla zjištěna rozsáhlá genomická divergence mezi začínajícími druhy Anopheles gambiae a An. coluzzii42. Tyto druhy byly původně identifikovány na základě rozdílů ve struktuře jejich ribozomální DNA jako formy S a M43 , ale později byl jejich taxonomický status povýšen na druhovou úroveň44. Předpokládá se, že An. gambiae a An. coluzzii vytvářejí reprodukční bariéry v sympatrii v důsledku rozdílů v jejich ekologických preferencích45. Larvální stadium An. gambiae je vázáno na malé dešťové kaluže. Naproti tomu An. coluzzi využívá trvalé vodní nádrže spojené s pěstováním rýže. Přestože prezygotické bariéry mezi druhy jsou neúplné46, vyvinuly se u nich rozdíly v chování při rojení47,48 a odlišné typy zpěvu49.

Vysoká úroveň divergence celého genomu, nápadný rozdíl v adaptaci na odlišné ekologické prostředí a důkazy o prezygotických a postzygotických bariérách pro páření naznačují, že Cx. p. pipiens a Cx. p. molestus představují odlišné ekologické jednotky, které procházejí počínající ekologickou speciací.

Hybridizace v komplexu Culex pipiens

Nejzajímavějším pozorováním členů komplexu Cx. pipiens je, že navzdory rozdílům v ekologii, fyziologii, chování a geografickém rozšíření mohou v přírodě stále hybridizovat a produkovat životaschopné potomstvo, což naznačuje, že reprodukční izolace mezi nimi není úplná. Naše studie také prokázala významné hybridizační události mezi poddruhy Cx. p. molestus a Cx. p. pipiens. Srovnání celého genomu ukázalo, že většina vzorků Cx. p. pipiens představuje jedince s určitým stupněm introgrese od Cx. p. molestus (obr. 4). Zaznamenali jsme vysoký rozpor mezi jadernou a mitochondriální fylogenezí (obr. 2, 8), což naznačuje, že historicky může docházet k přenosu mitochondriálních genomů mezi poddruhy. Zároveň jsme nezaznamenali haploskupiny sdílené mezi lokálními populacemi poddruhů. Na kontinentech byly všechny mitochondriální fylogeneze silně monofyletické, což ukazuje na samcem zprostředkované šíření a hybridizaci. Příměs s Cx. p. molestus byla vyšší u jižních populací Cx. p. pipiens v Kyrgyzské republice a ve Washingtonu, D.C., USA, ale nižší u severních populací v Běloruské republice a Chicagu, IL, USA. To by mohlo souviset s neschopností hybridů vyvinout diapauzu v chladném podnebí. Pro srovnání, mikrosatelitní analýza odhalila mírnou úroveň hybridizace mezi Cx. p. pipiens a Cx. p. molestus ~8 % v severních městech USA (Chicago, IL a New York, NY)30,50 . V jižní Evropě, kde se Cx. p. pipiens i Cx. p. molestus vyskytují v nadzemní části, byla úroveň hybridizace mezi nimi podobná a odhadovala se na 8-10 %51. Mnohem vyšší úroveň hybridizace byla zjištěna v jižních populacích na východě USA, kde bylo ~40 % všech vzorků identifikováno jako hybridi mezi Cx. p. molestus a Cx. p. pipiens19. Celková míra hybridizace mezi příslušníky Cx. pipiens byla tedy v Severní Americe vyšší než ve Starém světě. Pro srovnání, hybridizace mezi kryptickými druhy komplexu An. gambiae (An. gambiae a An. coluzzi) se významně pohybovala mezi 1 % v Mali46 až >20 % v Guineji Bissau52 , což je srovnatelné s celkovou mírou hybridizace mezi Cx. p. molestus a Cx. p. pipiens.

Zajímavé je, že v naší studii jsme v žádném vzorku Cx. p. molestus z Běloruské republiky, Kyrgyzské republiky a Chicaga, IL, USA, nestanovili příměs Cx. p. pipiens (obr. 4). Tato zjištění ukazují na velmi omezený nebo žádný tok genů z Cx. p. pipiens do Cx. p. molestus. Podobné nálezy asymetrické introgrese z Cx. p. molestus do Cx. p. pipiens ukázaly i předchozí studie20,51. Mechanismus asymetrické introgrese není v současné době znám. Jedna z hypotéz předpokládá, že samci Cx. p. molestus, kteří se mohou pářit v uzavřených prostorách, mohou hybridizovat jak se samicemi Cx. p. molestus, tak se samicemi Cx. p. pipiens. Naproti tomu Cx. p. pipiens, kteří vyžadují prostor pro rojení, mají větší dispozice k páření se samicemi Cx. p. pipiens51. K vysvětlení tohoto jevu je však zapotřebí dalších populačně genetických a experimentálních studií.

Nakonec naše studie prokázala, že u Cx. p. pipiens může dojít k autogenezi v důsledku adaptivní introgrese genetického materiálu z Cx. p. molestus. V terénním sběru vzorků z nadzemního a podzemního prostředí ve Washingtonu, D.C., USA, jsme vybrali komáry pro autogenii. Podzemní komáři byli autogenní, ale nadzemní komáři byli anautogenní. Při použití analýzy spojování sousedů však komáři z autogenních i anautogenních kolonií vytvořili jeden shluk (obr. 2). Navíc přístupy PCA (obr. 3) a ADMIXTURE (obr. 4) shlukují tyto vzorky společně s Cx. p. pipiens z jiných lokalit. Populace se smíšenými charakteristikami byly nalezeny v Evropě51 a v USA53. V Portugalsku byl u Cx. p. molestus54 zjištěn také neobvyklý vzorec chování při krmení ptáků krví.

Přítomnost probíhající hybridizace mezi členy komplexu Cx. pipiens naznačuje, že proces speciace mezi nimi není ukončen a postzygotické bariéry reprodukční izolace nejsou zcela vytvořeny. Celkově se domníváme, že členové komplexu Cx. pipiens představují pozoruhodný model pro studium různých aspektů geografické a ekologické speciace vzhledem k probíhajícímu toku genů mezi nimi a lokálním adaptacím na různá prostředí

.