Gama-glutamyltranspeptidáza

Aktivita a specifita

Reakce katalyzovaná tímto enzymem je tedy obecně chápána jako přenos γ-glutamylové skupiny na různé akceptorové molekuly, jako je voda, aminokyseliny, dipeptidy a samotný γ-glutamylový donor, v závislosti na reakčních podmínkách. Tyto katalytické vlastnosti jsou spojeny s katalytickým mechanismem GGT, v němž reakce probíhá mechanismem dvojího přemístění acylace-deacylace přes meziprodukt γ-glutamyl-enzymu.

Jak se dalo očekávat ze struktur přirozeného substrátu glutathionu a jeho derivátů, GGT striktně rozpoznává γ-glutamylovou část, ale má poměrně širokou substrátovou specifitu s ohledem na odcházející skupinu (Xaa). Glutathion, jeho S-konjugáty, glutathion disulfid, γ-glutamyl di- nebo tripeptidy, glutamin, l-α-methyl deriváty γ-glutamyl amidů, leukotrien C4, poly-γ-glutamyl deriváty jsou akceptovány jako substráty. Umělé substráty, jako je l-γ-glutamyl-p-nitroanilid (l-γ-Glu-pNA) a fluorescenční l-γ-glutamyl-7-amino-4-methylkumarin (l-γ-Glu-AMC), jsou aktivními substráty běžně používanými v přítomnosti nebo nepřítomnosti γ-glutamylových akceptorů (viz níže) pro transpeptidázový nebo hydrolázový test.

Specifičnost substrátu s ohledem na akceptor je nejrozsáhleji studována u GGT z ledvin potkanů . L-izomery neutrálních aminokyselin, jako jsou l-cystin, l-Gln, l-Met, l-Ala, l-Cys a l-Ser, jsou dobrými akceptory, ale hydrofobní aminokyseliny a aminokyseliny s rozvětveným řetězcem, jako jsou l-Phe, l-Trp, l-Leu, l-Ile a l-Val, jsou spíše špatnými substráty. d-Aminokyseliny a α-substituované aminokyseliny nepůsobí jako akceptorové substráty. Proto je použití d-γ-Glu-pNA vhodným způsobem potlačení autotranspeptidace při měření hydrolasové aktivity . Jelikož se akceptorové vazebné místo překrývá s podměty pro Cys-Gly část glutathionu, enzym preferuje jako akceptorové substráty dipeptidy s Gly na C-konci, jako jsou l-Met-Gly, l-Gln-Gly, l-Ala-Gly, l-cystinyl-bis-Gly, Gly-Gly a l-Ser-Gly v sestupném pořadí podle relativní aktivity . Peptidy s více než dvěma aminokyselinovými zbytky jsou velmi slabými akceptory. Hodnoty Km pro akceptorové aminokyseliny a dipeptidy jsou poměrně vysoké a pohybují se v rozmezí 0,1 až 5 mM , ale jako akceptorový substrát pro transpeptidázovou aktivitu je nejvhodnější Gly-Gly (Km=3 mM). Vysoké koncentrace akceptorových molekul inhibují GGT kompetitivně vůči donoru γ-glutamylu (γ-Glu-Xaa), pravděpodobně v důsledku překrývání vazebného místa pro Xaa a místa pro akceptor. Substrátová specifita vzhledem k substrátu Cys závisí na původu enzymu; například enzym E. coli preferuje v tomto místě bazické aminokyseliny (l-Arg, l-Lys a l-His) a aromatické aminokyseliny (l-Phe, l-Trp a l-DOPA) . Akceptorovou specifitu je však třeba brát s rezervou, protože zjevná aktivita závisí také na efektivní koncentraci deprotonované aminokyseliny dostupné při daném pH. Relativně vysoká aktivita pozorovaná u Gly-Gly je částečně způsobena nízkým pKa tohoto dipeptidu . Deprotonované aminoskupiny akceptorových substrátů se zdají být pro transpeptidaci nezbytné.

Nejpoužívanějším donorovým substrátem pro enzymový test je l-γ-Glu-pNA. Typická testovací směs pro transpeptidázovou aktivitu enzymu krysích ledvin se skládá z 5 mM l-γ-Glu-pNA, 100 mM Gly-Gly v 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0) při teplotě 25 °C. Přídavek dostatečné koncentrace Gly-Gly účinně potlačuje hydrolýzu a autotranspeptidaci. Optimální pH GGT je přibližně 7,5-9 pro transpeptidaci, ale závislost na pH je mnohem menší pro hydrolýzu . To je v souladu se skutečností, že zjevná transpeptidázová aktivita částečně závisí na účinné koncentraci volné aminoskupiny akceptorů .

Hydrolázová aktivita pro glutamin se přidáním modulátorů zaměřených na akceptorové místo, jako jsou maleát, hippurát a glykocholát, zvyšuje až 12krát. Přídavek těchto sloučenin inhibuje vazbu akceptorových substrátů a donorů γ-glutamylu, které obsazují subsity Cys-Gly. Přídavek γ-glutamylových donorů nebo vazba inhibitorů v místě γ-glutamylových donorů zvyšuje afinitu těchto modulátorů, což ukazuje na kooperativní interakce mezi vazebnými místy pro γ-glutamylové donory a akceptory (přehled viz Tate & Meister ). Předpokládá se, že akceptorové místo obsazené těmito modulátory podporuje konformační změnu GGT do aktivní formy, čímž usnadňuje vznik přechodného stavu. Tímto způsobem se také navrhuje vysvětlit zvýšení rychlosti inaktivace savčích enzymů acivicinem (vide infra), což však nebylo pozorováno při inhibici γ-monofluorofosfonátem, afinitní značkou analogu přechodného stavu zaměřeného na aktivní místo . Zdá se, že acivicin se váže na jiný nukleofilní zbytek, než je katalytický nukleofil savčího GGT .

GT je reverzibilně a kompetitivně inhibován l- a d-γ-glutamyl-(o-karboxy)fenylhydrazidem (anthglutinem, produkovaným Penicillium oxalicum) s Ki 8 μM a pro myši není hlášena akutní toxicita . Několik glutamátových analogů s reaktivní skupinou v blízkosti γ-karboxy působí jako ireverzibilní inhibitory. 6-Diazo-5-oxo-l-norleucin (DON), O-diazoacetyl-l-serin (l-azaserin) a l-(αS,5S)-α-amino-3-chloro-4,5-dihydro-5-isoxazoloctová kyselina (acivicin nebo AT-125, vyráběný Streptomyces sviceus) jsou silnými, ale nespecifickými inaktivátory GGT . Acivicin se hojně používá k potlačení aktivity GGT in vivo , ačkoli acivicin je vysoce toxický, protože inaktivuje řadu glutamin amidotransferáz, které se podílejí na biosyntéze nukleotidů, aminokyselin a aminocukrů . Serin-borátový komplex se reverzibilně váže na vazebné místo pro γ-glutamyl a inhibuje GGT s Ki 20 μM . Tento klasický poznatek vedl ke vzniku silného a pomalu se vážícího inhibitoru, kyseliny l-2-amino-3-boronobutanové (γ-boroGlu) . GGT je inhibována s celkovým Ki 17 nebo 35 nM, ale inhibice je stále reverzibilní. Kyselina 2-amino-4-(fluorofosforo)butanová (γ-PFGlu), analog glutamátu s elektrofilním fosforem nahrazujícím γ-karboxy, je účinným mechanismem a afinitním značením E. coli GGT zaměřeným na aktivní místo . Tato sloučenina rychle a ireverzibilně inhibuje GGT za vzniku stabilního, aniontového a tetraedrického aduktu podobného přechodnému stavu, který je vhodný pro peptidové mapování za účelem identifikace katalytického nukleofilu E. coli GGT (vide infra). Řada γ-(monofenyl)fosfono- a γ-fosfonodiesterových glutamátových analogů slouží jako inhibitory založené na mechanismu, které ireverzibilně inhibují GGT kovalentní modifikací jeho katalytického nukleofilu. Zejména γ-fosfonodiestery, které obsahují strukturní napodobeninu Cys-Gly a jeho C-koncovou karboxylovou skupinu, vykazují mimořádně vysokou aktivitu vůči lidské GGT, přičemž rychlost inaktivace je 130 až 6000krát vyšší než u acivicinu. Inhibice je selektivní pro GGT a není pozorována žádná toxicita. Jeden z těchto inhibitorů je komerčně dostupný pod názvem „GGsTop“ (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

Vysokokapacitním screeningem byl nalezen neglutamátový analogový inhibitor lidské GGT . Tato sloučenina obsazuje akceptorové místo γ-glutamylového substrátového komplexu s Ki 17,6 μM. Inhibitor je druhově selektivní, ale je reverzibilní a je zaznamenána určitá toxicita.

Předpokládá se, že reakce katalyzovaná GGT probíhá mechanismem ping-pong přes γ-glutamyl-enzymový meziprodukt, jak bylo pozorováno u serinhydrolas . N-koncový Thr Oγ v malé podjednotce je katalytickým nukleofilem, na který je navázána γ-glutamylové skupina (viz Strukturní chemie). Katalytický nukleofil GGT byl poprvé identifikován u E. coli GGT jako N-terminální zbytek Thr (Thr391) v malé podjednotce pomocí peptidového mapování enzymu inaktivovaného γ-PFGlu . Tento zbytek, odpovídající Thr380 (enzym krysí ledviny) a Thr381 (lidský enzym), je konzervován mezi všemi GGT, jejichž primární sekvence jsou známy. Katalytický nukleofil lidského GGT byl identifikován jako Thr381 pomocí peptidového mapování enzymu inaktivovaného γ-(monofenyl)fosfonovou afinitní značkou . Reakce katalyzovaná GGT tedy začíná nukleofilním atakem N-koncového zbytku Thr v malé podjednotce na γ-karboxy donorového substrátu (γ-Glu-Xaa) za účelem odstranění Xaa. Takto vzniklý γ-glutamyl enzym reaguje s vodou (hydrolýza) nebo s aminokyselinami a dipeptidy (transpeptidace a autotranspeptidace) v kroku určujícím rychlost .

GT patří mezi N-terminální nukleofilní hydrolázy (Ntn-hydrolázy), jak se předpokládá z jejího jedinečného složení a procesu zrání, při kterém vzniká aktivní dimerní forma zralého enzymu posttranslačním autokatalytickým zpracováním katalyticky neaktivního prekurzoru. To potvrzuje mutageneze řízená na místě a rentgenová strukturní analýza bakteriálních enzymů (viz Strukturní chemie).

.