Articles / 19 ledna, 2022

Frontiers in Physiology

Úvod

Projekt HUMAN GENOME změnil naše chápání základní jednotky genetické informace a RNA se ukázala jako univerzální regulátor centrálních buněčných procesů (Thum a Condorelli, 2015). Nekódující RNA (ncRNA), transkripty, které nekódují proteiny, tvoří největší třídu a libovolně se dělí na malé (<200 nukleotidů) a dlouhé nekódující RNA (lncRNA (>200 nukleotidů). Nejlépe prozkoumanými malými ncRNA jsou mikroRNA (miRNA), které představují další vrstvu posttranskripčních regulátorů, jež pohlcují poruchy a zajišťují robustnost biologických systémů (Liu a Olson, 2010; Ebert a Sharp, 2012; Rotllan a kol., 2016).

Významné úsilí je nyní zaměřeno na rozčlenění funkce lncRNA. Bylo zjištěno, že v kardiovaskulárním systému hrají lncRNA klíčovou roli ve fyziologii a nemoci a bylo zkoumáno cílení na lncRNA pro nové terapeutické zásahy (Uchida a Dimmeler, 2015; Boon a kol., 2016; Buhrke a kol., 2018). Zde se budeme zabývat experimentálními nástroji pro určení struktury RNA, které mohou nabídnout jedinečný pohled na funkci lncRNA v kardiovaskulárním systému.

Problémy při posuzování funkčnosti lncRNA

Jedinečné vlastnosti lncRNA byly rozsáhle zkoumány (Guttman a Rinn, 2012; Ulitsky a Bartel, 2013; Bar a kol., 2016; Ulitsky, 2016). Několik vlastností lncRNA činí funkční hodnocení náročným. Typicky lncRNA vykazují slabou konzervaci napříč druhy, přičemž vykazují pouze „skvrny“ konzervovaných bází obklopené velkými zdánlivě nekonzervovanými sekvencemi (Ponjavic a kol., 2007; Guttman a kol., 2009; Necsulea a kol., 2014; Washietl a kol., 2014). Navíc lncRNA vykazují nízkou abundanci, která omezuje způsob a místa jejich působení (Mercer et al., 2008; Cabili et al., 2011, 2015; Washietl et al., 2014; Ulitsky, 2016; Wilk et al., 2016; Jandura a Krause, 2017). Z hlediska způsobů funkce byla popsána jak cis-, tak transregulační aktivita (Mercer a Mattick, 2013). Jako cis-regulátory uplatňují lncRNA svou funkci na sousední geny na stejné alele, ze které jsou přepisovány, a vykazují korelaci a narušení exprese alelově specifickým způsobem. Bylo prokázáno, že CARMEN, lncRNA asociovaná s enhancerem a klíčový regulátor srdeční specifikace v lidských srdečních progenitorových buňkách, působí in cis při kontrole exprese miR-143/145 (Ounzain et al., 2015). Na druhou stranu působením v cis mohou lncRNA řídit expresi genů ve vzdálenosti od místa své transkripce, a to změnou stavu chromatinu, ovlivněním jaderné struktury nebo regulací funkce proteinů (Vance a Ponting, 2014; Kopp a Mendell, 2018).

Zajímavé je, že u některých lncRNA s nízkou abundancí se zdá být důležitější akt transkripce než samotný transkript. V zásadní studii Engreitz et al. (2016) geneticky manipulovali s 12 genomovými lokusy, které produkují lncRNA, a zjistili, že 5 lokusů ovlivňuje expresi sousedního genu in cis. Exprese samotných transkriptů lncRNA nebyla nutná, ale rozhodující byly naopak procesy spojené s jejich transkripcí (Engreitz et al., 2016).

RNA Interaktom

Výše uvedená funkční všestrannost lncRNA vyplývá z jejich schopnosti přizpůsobovat se různým strukturám a molekulárním interakcím s proteiny, RNA a DNA (Guttman a Rinn, 2012; Marchese et al., 2017). V ribonukleoproteinových komplexech (RNP) mohou lncRNA působit jako lešení, které komplexy stabilizuje a nasměruje je na konkrétní subcelulární lokusy nebo na DNA. V endoteliálních buňkách interakce lncRNA MANTIS s katalytickými podjednotkami ATPázy propůjčuje specifičnost chromatinově remodelačnímu komplexu switch/sucrose non-ferentable (SWI/SNF), který jej směruje k podskupině angiogenních genů a usnadňuje remodelaci nukleozomů a iniciaci transkripce (Leisegang et al., 2017; Zampetaki a Mayr, 2017). Vazba lncRNA na specifické ATPázové podjednotky komplexu SWI/SNF je totiž běžným regulačním mechanismem (Cajigas et al., 2015; Zhu et al., 2016).

Interakce lncRNA s chromatinovými komplexy je obzvláště důležitá, protože tyto lncRNA-RNPs mohou spouštět modifikace chromatinu prostřednictvím interference s chromatin-modifikačními stroji (Tsai et al., 2010; Brockdorff, 2013; Simon et al., 2013). V srdci působí lncRNA Chaer obohacená o kardiální lncRNA jako epigenetický přepínač tím, že interferuje s polykombresivním komplexem 2 (PRC2) a inhibuje H3K27m3 u genů podílejících se na srdeční hypertrofii (Wang et al., 2016), zatímco mezodermální víru určující lncRNA Fendrr se může vázat jak na PRC2, tak na komplexy Trithorax group/MLL (TrxG/MLL) a působit jako jemný tuner (Grote et al., 2013).

Kromě proteinů byly popsány také interakce lncRNA s DNA. To může vést k tvorbě triplexu RNA-DNA, struktury, která je rozšířená in vivo a usnadňuje rozpoznávání cílových genů lncRNA (Mondal et al., 2015). Tato interakce byla elegantně prokázána u MEG3, lncRNA obohacené o srdeční fibroblasty, která podporuje fibrózu (Piccoli et al., 2017). MEG3 interaguje s komplexem PRC2 a vytváří RNA-DNA triplexové struktury prostřednictvím vazebných míst bohatých na GA sekvence. Chromatinová imunoprecipitace RNA odhalila, že MEG3 moduluje aktivitu genů dráhy TGF-b a k rozpoznání cíle dochází prostřednictvím triplexových struktur (Mondal et al., 2015).

Regulační funkce dlouhých nekódujících RNA také závisí na interakcích RNA-RNA. Křížová interakce s miRNA vytváří složitou síť, která vykonává posttranskripční regulaci genové exprese. LncRNA mohou ukrývat vazebná místa pro miRNA a fungovat jako molekulární návnady nebo houby, které sekvestrují miRNA od ostatních transkriptů. Za zmínku stojí, že byla zaznamenána konkurence mezi lncRNA a miRNA o vazbu na cílové mRNA, která vede k de-represi genové exprese (Yoon et al., 2014; Ballantyne et al., 2016). A konečně, lncRNA mohou obsahovat vložené sekvence miRNA a sloužit jako zdroj miRNA (Piccoli et al., 2017).

Linking RNA Structure to Function

Molekuly RNA přijímají terciární interakce vyššího řádu (Staple a Butcher, 2005; Wan et al., 2011). Přestože se objevují vazby mezi strukturou a funkcí, strukturní domény, které dominují RNA interaktomu, stále nejsou dobře definovány. Funkční důsledky struktury transkriptu jsou lépe pochopeny při zpracování primárních miRNA (primiRNA) na zralé miRNA. Pomocí mnohonásobných mutagenetických testů byly definovány sekundární struktury, jako je délka kmene, párování vlásenek, velikost a poloha výčnělku a velikost apikální smyčky, které přispívají k účinné biogenezi miRNA (Auyeung et al., 2013; Fang a Bartel, 2015; Nguyen et al., 2015; Roden et al., 2017). U shlukových miRNA, které se skládají z více genů miRNA, bylo také navrženo, že terciární struktura přispívá ke zpracování na jednotlivé zralé miRNA. Byla prokázána autoregulační role terciární struktury klastru miR-17∼92 při jejím zrání a vazbě pomocných faktorů na konzervované terminální smyčky (Chakraborty et al., 2012). Nedávno bylo u klastru miR-497∼195 zjištěno, že mutace ve vlásence miR-195a ovlivňují zpracování miR-497a, která se nachází ve stejném klastru. Výpočetní analýza poukázala na rozdíly v terciární struktuře primiRNA u mutantů, které mohou ovlivnit proces zrání (Lataniotis et al., 2017). Z jiného soudku, u primiR-30c-1 terciární struktura podporuje interakci s SRSF3, členem rodiny SR proteinů, který usnadňuje rozpoznávání a zpracování primiRNA. Jediná sekvenční odchylka G/A vede ke strukturní přestavbě apikální oblasti primiRNA, která ovlivňuje konzervované zbytky umístěné v bazální části kmene a generaci zralé miRNA (Fernandez et al., 2017).

U lncRNA může selekce působící spíše na strukturu než na primární sekvenci vysvětlit rychlé tempo evoluce, které vedlo k hypotéze „modulárního kódu RNA“ založené na názoru, že selekce působí na strukturní domény (Wutz et al., 2002; Tsai et al., 2010; Guttman a Rinn, 2012). Tento koncept podporují i některé experimentální důkazy. Gen lncRNA MEG3 obsahuje tři odlišné strukturní moduly M1, M2 a M3. Deleční analýza ukázala, že motivy M2 a M3 jsou důležité pro aktivaci p53. Zajímavé je, že hybridní transkript MEG3, v němž byla polovina primární sekvence v motivu M2 nahrazena zcela nepříbuznou umělou sekvencí, která vykazovala podobnou sekundární strukturu, byl plně funkční při stimulaci transkripce zprostředkované p53 (Zhang et al., 2010).

Metody určování struktury RNA

Metody chemického a enzymatického sondování mohou umožnit pochopení sekundární struktury RNA (Ehresmann et al., 1987). Enzymatické sondování se opírá o nukleázy, které se vážou na párovou a nepárovou RNA a štěpí ji za vzniku fragmentů RNA, které lze analyzovat. Naproti tomu při chemickém sondování se používají chemikálie malých rozměrů, které reagují a kovalentně modifikují nukleotidy přístupné rozpouštědlu. Po modifikaci nebo štěpení se obvykle mapují pozice pomocí reverzní transkripce, která buď zastaví, nebo zavede mutaci do cDNA (Wilkinson et al., 2006). Analýza výsledné cDNA se pak používá k určení polohy nukleotidů a frekvence modifikací. K přímému sekvenování produktů cDNA lze použít sekvenování nové generace (NGS). To umožňuje charakterizaci struktury RNA na úrovni celého transkriptomu v jediném experimentu (Lucks et al., 2011; Incarnato et al., 2014; Loughrey et al., 2014; Rouskin et al., 2014). Ačkoli původně byly tyto technologie vytvořeny pro analýzu struktury RNA in vitro, byla popsána i strukturní charakterizace in vivo především pomocí sond, které mohou rychle difundovat přes membrány (Spitale et al., 2013; Ding et al., 2014; Spitale et al., 2015; Flynn et al.,

Enzymatické sondování

PARS

PARS (paralelní analýza struktury RNA) je vysoce výkonná metoda enzymatického sondování, která měří strukturní vlastnosti izolovaných poolů polyadenylovaných transkriptů, které jsou renaturovány in vitro a ošetřeny RNázou V1 nebo S1. RNáza V1 a RNáza S1 štěpí 3′ fosfodiesterové vazby dvouvláknové, respektive jednovláknové RNA, což umožňuje vyhodnocení dvouvláknové nebo jednovláknové konformace (Kertesz et al., 2010).

Frag-Seq

Frag-Seq (fragmentační sekvenování) je enzymatická metoda, která používá nukleázu P1 ke specifickému štěpení jednovláknové RNA. Vysoce výkonné sekvenování pak analyzuje vzniklé fragmenty. Tento pracovní postup poskytuje „profil přístupnosti RNA“, který je přirovnáván k testům hypersenzitivity DNázy na chromatin (Underwood et al., 2010). Za zmínku stojí, že Frag-seq izoluje fragmenty <200 bází po štěpení RNázou P1, tudíž velké RNA mohou být nedostatečně zastoupeny. Vzhledem k tomu, že Frag-seq a PARS mohou poskytovat komplementární data, mohl by kombinovaný přístup zlepšit přesnost měření struktury RNA v celém genomu (Wan et al.,

Chemical Probing

DMS Probing

Dimethylsulfát (DMS) je činidlo specifické pro bázi, které může vázat a měnit metylační stav nepárových adenosinových a cytosinových nukleotidů (Tijerina et al., 2007; Rouskin et al., 2014). DMS footprinting je optimalizován pro strukturní analýzu RNA. Vazba proteinu na RNA vytváří „stopu“, kterou lze vysledovat díky změnám ve struktuře RNA. Velikost transkriptu, kterou lze hodnotit, je poměrně malá (<500 nt), ale tuto metodu lze provádět jak in vitro, tak in vivo, protože DMS může snadno proniknout buněčnou membránou. DMS-seq, který kombinuje metylaci DMS s NGS, byl nedávno proveden in vivo (Ding et al., 2014; Rouskin et al., 2014).

Targeted Structure-Seq

Targeted Structure-Seq spočívá v tom, že metylace RNA pomocí DMS se provádí in vivo. Následně je RNA izolována z buněk a metylační místa jsou určena pomocí genově specifických primerů pro reakci reverzní transkripce. Sekvenování fragmentů získaných DMS lze použít k posouzení buněčné konformace RNA. Na základě této metody byly vyvinuty strukturní modely prvků v rámci Xist (Fang et al., 2015). Ačkoli byl tento pracovní postup původně popsán s použitím DMS, lze jej přizpůsobit i pro jiná sondovací činidla.

SHAPE

SHAPE (selektivní 2′-hydroxylace acylací pomocí prodloužení primerů) může zkoumat strukturu RNA in vitro i in vivo pomocí chemické látky NMIA a jejích derivátů k detekci flexibilních oblastí v sekundární struktuře RNA (Wilkinson et al., 2006; Weeks a Mauger, 2011). Bylo testováno několik činidel SHAPE s cílem zlepšit poměr signálu k pozadí (Lee et al., 2017). Při SHAPE jsou 2′-hydroxylové skupiny všech čtyř nukleotidů selektivně acylovány, pokud jsou flexibilní a nepárové. To vede k tvorbě kovalentních aduktů SHAPE, které blokují zpětnou transkripci, což vede ke zkráceným fragmentům cDNA. Reaktivity SHAPE pak lze použít k modelování sekundárních struktur a ke kvantifikaci jakéhokoli procesu, který moduluje dynamiku RNA.

SHAPE-MaP

SHAPE-MaP (SHAPE a mutační profilování) jako první kombinoval protokol SHAPE s NGS. Technika SHAPE-MaP, která byla původně provedena a popsána za účelem definování genomu HIV-1 RNA, je vysoce citlivá technika, která umožnila rychlé objevení de novo a přímé ověření nových funkčních motivů (Siegfried et al., 2014; Mustoe et al., 2018).

In-cell SHAPE-Seq

In-cell SHAPE-Seq je modifikace techniky SHAPE-Seq, která kombinuje SHAPE-seq s měřením genové exprese za účelem objasnění souvislosti struktury a funkce RNA in vivo. Odhalila translační regulační mechanismy v E. coli in vivo (Watters et al., 2016).

icSHAPE-seq

icSHAPE-seq (in vivo click SHAPE sequencing) používá in-cell SHAPE chemickou látku NAI-N3, po níž následuje selektivní chemické obohacení RNA modifikované NAI-N3, které poskytuje lepší poměr signál/šum (Flynn et al., 2016). Následná NGS umožňuje přesnou identifikaci s rozlišením jednoho nukleotidu. U myších embryonálních kmenových buněk bylo prokázáno, že in vitro je skládání RNA programováno výhradně sekvencí, zatímco in vivo závisí struktura RNA na kontextu intracelulárního prostředí a interakci s proteiny vážícími RNA, což může vést k fokálním strukturním přestavbám (Spitale et al., 2015). Proto tento test nabízí vzrušující možnost sledovat strukturu RNA in vivo v přítomnosti nebo nepřítomnosti stimulace.

Determinace struktury a interakcí RNA

PARIS

PARIS (psoralenová analýza interakcí a struktur RNA) byl nedávno vyvinut pro stanovení struktury i interakcí RNA in vivo. K fixaci párů bází v živých buňkách používá vysoce specifický a reverzibilní síťovač nukleových kyselin, psoralenový derivát 4′-aminomethyltrioxsalenu. Následné částečné štěpení RNázou a úplné štěpení proteinázou vede k purifikaci souboru malých zesíťovaných a přímo s bázemi spárovaných fragmentů RNA. Purifikace zesíťovaných fragmentů pomocí 2D elektroforézy, následovaná proximitní ligací duplexních fragmentů RNA, obrácením příčných vazeb a vysokokapacitním sekvenováním odhalí přímé párování bází mezi fragmenty. Na základě těchto čtení lze generovat modely struktur a interakcí RNA s vysokou specifičností a citlivostí (Lu et al., 2016). Pomocí tohoto přístupu byl dotazován model struktury vyššího řádu Xist (Lu et al., 2016). Povzbudivé je, že tato zjištění jsou v souladu s krystalografickými studiemi definovaných domén in vitro (Arieti et al., 2014).

určení struktury lncRNA

Určení struktury lncRNA in vivo je nesmírně náročné, protože jsou vysoce heterogenní s oblastmi s dobře definovaným párováním bází, jinými bez párování bází a oblastmi s více strukturami. Kromě toho se lncRNA mohou táhnout přes tisíce nukleotidů, jsou exprimovány v nízkém množství a bývají součástí vícesložkových komplexů (Busan a Weeks, 2017). Přesto byla struktura několika lncRNA experimentálně určena (tabulka 1).

Tabulka 1

Tabulka 1. Určení struktury lncRNA.

Xist

Jedná se o velmi dlouhou lncRNA (17 000 nukleotidů), která řídí inaktivaci chromozomu X. Je to lncRNA, která se vyskytuje na chromozomu X, a jejíž struktura se mění. Šíří se po celém chromozomu a zároveň spouští stabilní epigenetické modifikace prostřednictvím náboru komplexu PRC2 a obohacení o represivní modifikaci chromatinu H3K27me3 (Simon et al., 2013; Fang et al., 2015; Smola et al., 2016). Data in vivo SHAPE identifikovala v genu Xist 33 oblastí, které tvoří dobře definované sekundární struktury propojené strukturně variabilními a dynamickými oblastmi.

RepA

Jedná se o 1 600 nukleotidů dlouhou myší lncRNA kódovanou vnitřním promotorem na smysluplném vlákně genu Xist. Použitím chemických sond SHAPE a DMS in vitro byla odhalena složitá struktura tří nezávisle se skládajících modulů. Fylogenetická analýza a počítačové 3D modelování prokázaly definovanou terciární architekturu, která se může tvořit autonomně v nepřítomnosti proteinových partnerů (Liu et al., 2017a).

Rox1/Rox2

U drozofily je kompenzace dávkování dosahováno pomocí dvou lncRNA, které jsou přepisovány z chromozomu X. U drozofily je kompenzace dávkování dosahováno pomocí dvou lncRNA, které jsou přepisovány z X chromozomu. RNA na X 1 a 2 (roX1 a roX2) mají délku 3 700, respektive 1 200 nukleotidů. In vitro sondování SHAPE a analýza PARS odhalily společné, konzervované a odlišné strukturní motivy, které mohou fungovat jako cílová místa a montážní platformy pro mužský specifický letální komplex (Ilik et al., 2013).

SRA

Lidský aktivátor steroidních receptorů RNA (SRA) je 870 nukleotidová lncRNA, která je odvozena od genu kódujícího jak lncRNA, tak transkripty kódující proteiny. Struktura SRA byla experimentálně zkoumána pomocí chemických sond SHAPE a DMS in vitro. Souběžně bylo provedeno enzymatické sondování RNase V1. Ukázalo se, že SRA se skládá ze čtyř odlišných domén s různými sekundárními strukturami (Novikova et al., 2012). Ještě důležitější je, že srovnávací strukturní analýza mezi myší a člověkem silně naznačila, že velké množství evolučních změn mělo minimální mutační vliv na protein odvozený z lokusu a zároveň stabilizovalo strukturní jádro RNA (Novikova et al.,

HOTAIR

V souvislosti se sporadickým aneuryzmatem hrudní aorty prostřednictvím regulace ukládání extracelulární matrix a apoptózy buněk hladkého svalstva lidské aorty hraje tato lncRNA klíčovou roli v kardiovaskulárním systému (Guo et al., 2017). U pacientů v jiném než konečném stadiu srdečního selhání patřila HOTAIR mezi panel lncRNA, které byly významně modulovány (Greco et al., 2016). Byla také navržena ochranná role HOTAIR v kardiomyocytech (Gao et al., 2017) a jako cirkulujícího biomarkeru u akutního infarktu myokardu a vrozených srdečních vad (Jiang et al., 2018). Hotair je dlouhý 2 148 nukleotidů, což činí strukturní určení extrémně náročným. Pro řešení tohoto problému byl vytvořen nedenaturovaný purifikační protokol pro získání homogenní a monodisperzní formy. Strukturní moduly a odlišné evolučně konzervované prvky byly určeny in vitro pomocí chemického sondování s činidly SHAPE a DMS (Somarowthu et al., 2015).

Braveheart

Braveheart je 590 nukleotidová lncRNA, která působí in trans při regulaci kardiovaskulárního lineárního závazku. Její sekundární struktura byla experimentálně hodnocena pomocí sondování SHAPE a DMS in vitro. Ukázalo se, že Braveheart je uspořádán do velmi složité modulární struktury sestávající ze tří domén, která se skládá z 12 šroubovic, 8 terminálních smyček, 5 rozměrných vnitřních smyček a pěticestného spoje. Zajímavé je, že obsahuje 5′ asymetrickou vnitřní smyčku bohatou na G (AGIL) a 55 nukleotidový úsek na 3′ konci, který vykazuje vysokou reaktivitu naznačující nízkou pravděpodobnost struktury. Genetická delece tohoto specifického 11 nukleotidového fragmentu prokázala, že motiv AGIL je nezbytný pro diferenciaci myších embryonálních kmenových buněk na kardiomyocyty prostřednictvím vazby zing-finger proteinu CNBP/ZNF9 (Xue et al., 2016).

Budoucí směry

Strukturování RNA v kombinaci s genetickými manipulacemi může objasnit důležité funkční domény lncRNA. Za tímto účelem by měly být integrovány pokročilé experimentální nástroje, bioinformatika a genomové inženýrství. Systém editace genů CRISPR/Cas9 se ukázal jako robustní technologie, kterou lze použít k vytváření cílených modifikací v přesných genomových lokusech. Cas9, nukleázu, která dokáže vyvolat dvouvláknové zlomy (DSB) v DNA, lze navádět do bezprostřední blízkosti protoadaptačního motivu NGG pomocí molekuly RNA (sgRNA) sestávající z malé 20 nukleotidů dlouhé variabilní sekvence a adaptorové transaktivační RNA. V primárních buňkách a in vivo v myších modelech onemocnění (Platt et al., 2014; Abrahimi et al., 2015) lze v místě DSB zavést přesné inzerce, delece nebo záměny bází (Lin et al., 2014). Modifikovaná verze systému CRISPR/Cas9 byla nedávno použita pro screening funkčních lncRNA v měřítku genomu. Tento interferenční přístup CRISPR využívá mrtvou nukleázu Cas9 (dCas9), která není schopna vyvolat DSB do DNA. Fúzovaná s represorovou doménou (např. KRAB) (Liu et al., 2017b) nebo aktivační doménou (např. VP64) (Konermann et al., 2015; Bester et al., 2018) dCas9 a může být naváděna sgRNA na specifické lokusy v regulační oblasti v horním proudu k vyvolání represe, resp. aktivace transkripce lncRNA. Takové přístupy jsou mimořádně užitečné pro testování funkčnosti lncRNA vysokokapacitním způsobem.

Po identifikaci specifických lncRNA jsou pro určení modulů a strukturních domén lncRNA rozhodující technologie, které mohou definovat strukturu lncRNA in vivo. Určení struktury RNA lze spojit s analýzou srovnávací genomiky, která zohlední zachování polohy a skutečnost, že lncRNA se mohou opírat spíše o krátké prvky než o dlouhé úseky konzervovaných sekvencí. Genetické studie, které mohou přesně cílit na tyto strukturní domény při zachování exprese lncRNA (Matsumoto et al., 2017), vymezí funkční dopad těchto motivů. Použití editace genů CRISPR/Cas9 v indukovaných pluripotentních kmenových buňkách, které mohou být klonálně expandovány, upraveny tak, aby nesly definované delece strukturních motivů, a diferencovány na jiné buněčné typy (Cochrane et al., 2017; Granata et al., 2017) může poskytnout přesvědčivé důkazy o funkčním dopadu těchto domén v kardiovaskulárním systému. Potenciál těchto prvků jako nových cílů by mohl být dále zkoumán pro přesné zásahy vhodné pro terapeutické aplikace.

Příspěvky autorů

AZ inicioval studii, navrhl její strukturu a napsal rukopis. AA poskytl koncepční rady a revidoval rukopis. KS navrhl strukturu přehledu, poskytl koncepční rady a revidoval rukopis. Všichni autoři přečetli a schválili předloženou verzi.

Financování

Tato práce byla financována British Heart Foundation. AZ je Intermediate Fellow of the British Heart Foundation (FS/13/18/30207).

Prohlášení o střetu zájmů

Autoři prohlašují, že výzkum byl prováděn bez jakýchkoli komerčních nebo finančních vztahů, které by mohly být chápány jako potenciální střet zájmů.

Abrahimi, P., Chang, W. G., Kluger, M. S., Qyang, Y., Tellides, G., Saltzman, W. M., et al. (2015). Účinné narušení genů v kultivovaných primárních lidských endoteliálních buňkách pomocí CRISPR/Cas9. Circ. Res. 117, 121-128. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.117.306290