F-aktin

Krystalová struktura F-aktinu, 2zwh

Filamentární aktinové jednotky (F-aktin) se také označují jako mikrofilamenta a jsou vysoce konzervované, bílkovinné komponenty, které se téměř všudypřítomně vyskytují v eukaryotických cytoskeletech. F-aktin a další aktinové proteiny mají v buňkách obecně strukturální úlohu.

Úvod

Aktin se nachází téměř ve všech eukaryotických buňkách a je známý především díky své funkci strukturálního a translokačního proteinu. Má také funkci ATPázy, protože hydrolyzuje ATP na ADP a Pi a při každé hydrolýze podléhá konformačním změnám. Aktin patří díky své konformační změně závislé na nukleotidech do aktinové superrodiny, která zahrnuje další proteiny, jako jsou Hsp70(DnaK), Hsc70 a hexokináza. Vzhledem k podobnosti pozorované u Escherichia Coli, Hsc70 a ATPázové domény aktinu se předpokládá, že tyto dva proteiny mají společné předky. U prokaryot není aktin znám, mají však homolog aktinu, MreB, což rovněž vede k myšlence možného společného původu.

Aktin se vyskytuje ve dvou formách: globulární aktin (G-aktin), volné monomerní jednotky aktinu, a vláknitý aktin (F-aktin), což je polymerní forma. Tyto dvě formy existují ve vzájemné dynamické rovnováze, protože v buňce neustále probíhá polymerizace a depolymerizace spojená s ATP. Monomerní jednotky ve F-aktinu mají formu, která se liší od volné monomerní formy, a právě v důsledku této změny lze pozorovat specifičtější ATPázovou aktivitu.

Sestava

(1J6Z).

G-aktin je volná monomerní forma aktinu, která polymeruje na F-aktin. Struktury globulárního a vláknitého aktinu se od sebe v mnoha ohledech liší, přestože G-aktin obsahuje F-aktin. Když monomerní aktin polymerizuje do F-aktinu, jednotka se zploští. F-aktin má také funkci ATPázy, která je u G-aktinu minimální. Domény a aktivní místo jsou z hlediska složek stejné a budou diskutovány později z hlediska monomeru F-aktinu.

Zdá se, že G-aktin má ve své struktuře více ligandů vně aktivního místa. Předpokládá se, že pouze 3 z 5 skutečně existují v roztoku a že přispívají k polymeraci G-aktinu na F-aktin. Toto zastoupení G-aktinu má také, které je pozorováno v některých krystalických strukturách aktinu, ale ne nutně. Pozorovaná molekula na Cys374, byla použita k zablokování polymerační aktivity, takže bylo možné pozorovat krystal G-aktinu

Tvorba F-aktinu je dynamický proces skládání a rozkládání, který byl označen jako „šlapání“. Přechod mezi G-aktinem a F-aktinem začíná stabilizovaným oligomerem jednotek ATP-aktinu, který vzniká pomocí vzorce skládání typu nukleace-kondenzace. Následně dochází k přidávání ATP-monomerních jednotek na oba konce, avšak v důsledku rozdílu v polaritě náboje na obou koncích dochází k přednostnímu přidávání na tzv. plusový (+) konec nebo „ostnatý konec“. Na opačném konci, „minusovém (-) konci“ nebo „špičatém konci“, dochází k přednostní disociaci aktinových jednotek.

Po připojení aktinu vázaného na ATP dochází k hydrolýze ATP za vzniku stavu vázaného na ADP a Pi. Následnou ztrátou Pi zůstává stav ADP-aktin. Vzhledem k možnosti přidání nebo odebrání monomerních jednotek na obou koncích lze sestavení F-aktinu popsat v termínech rovnováhy. Protože však rychlost asociace ATP-aktinu je desetkrát vyšší než rychlost disociace ADP-aktinu, má f-aktin vzhled pohybu vpřed neboli „šlapání“. Monomery ADP-aktinu disociují na mínusovém konci a recyklují se na ATP-aktin, takže může opět dojít k polymerizaci na plusovém konci.

Struktura

Historie struktury

Bílkovinu f-aktin objevil Straub v roce 1942. O struktuře se spekulovalo na základě rentgenové krystalografie s nízkým rozlišením nalezené v roce 1990 Holmesem a spol. a v průběhu této doby byl přijat „Holmesův model“. Naproti tomu struktura G-aktinu byla nezávisle určena více než 30krát. Model F-aktinu s vyšším rozlišením byl do databanky PDB uložen teprve nedávno v prosinci 2008 Odou a kol. .

Monomer a polymer F-aktinu

(2zwh)

Monomer

Každá monomerní jednotka F-aktinu má jako součást své terciární struktury několik smyček, které jsou důležité pro její sestavení do polymerního F-aktinu. Tyto smyčky podléhají konformačním změnám v závislosti na stavu navázaného nukleotidu nebo slouží jako oblasti, na které se vážou sousední monomerní aktinové jednotky. Fungují jako „přepínač“ konformací na základě navázaného nukleotidu. Zbytky vazebné smyčky DNAse I (40-50) kromě toho, že podléhají konformačním změnám, které ovlivňují stabilitu, vážou enzymy DNAse I a předpokládá se, že udržují DNAse I. Hydrofobní smyčka , zahrnující zbytky 264-273, a , zahrnující zbytky 165-172, fungují jako místa, na která se mohou vázat sousední monomerní smyčky D aktinu. Podobnou funkci mají i zbytky (374-375).

Molekula F-aktinu, jak je zde znázorněna, se skládá z 375 zbytků(43kDa) a dvou ligandů, ADP a Ca2+. Má dvě hlavní domény oddělené štěrbinou vázající nukleotidy. V závislosti na stavu navázaného nukleotidu se mění nejstabilnější konformace F-aktinu. Ve stavech s navázaným nukleotidem ATP a ADP + Pi má uzavřenou vazebnou štěrbinu. Ve stavu, kdy je vázán pouze ADP, má širší vazebnou štěrbinuHarakteristickým rysem aktinu je, že domény zůstávají vůči sobě stočené, a to i přes konformační změny závislé na stavu nukleotidu.

Polymer F-aktinu (podle struktury F-aktinu Kena Holmese)

Polymer

F-aktin má podobu dvou pravotočivých šroubovic s postupným stáčením kolem sebe. Ve skutečnosti se skládá z opakování 13 aktinových jednotek na každých 6 levotočivých závitů, které pokrývají délku 350 Å.

Konformační změny závislé na stavu nukleotidu

Stav vázaného fosforylovaného nukleotidu ovlivňuje, jakou konformaci monomer F-aktinu zaujme. Přítomnost gama-fosfátu v aktivním místě způsobuje rotaci zbytku Ser14. Tato změna vede k posunu metylovaného histidinu (HIC73), což mění aktivní místo F-aktinu a způsobuje konformační změnu v D-smyčce. HIC73 se nachází v „senzorové smyčce“ neboli „přepínači“ pro propojení změn vázaného nukleotidu s konformačními změnami. U ATP-aktinu a ADP-Pi-aktinu je smyčka D nestrukturovaná. Ve formě F-aktinu vázaného na ADP je v D-smyčce monomeru běžně patrná alfa šroubovice.

Ačkoli alfa-helix není pozorován v tomto modelu F-aktinu podle Ody a není pozorován ani v některých jiných studiích F-aktinu, Oda et. al. připouští, že experimentální výsledky mohly vést k prodlouženému alfa-helixu v modelu, na rozdíl od prodlouženého neuspořádaného vlákna jako interagujícího segmentu mezi monomerními jednotkami F-aktinu.

Domény

(2zwh)

Struktura jedné jednotky F-aktinu vzniká z jednoho polypeptidového řetězce se dvěma doménami. Mezi oběma doménami lze pozorovat nukleotidovou vazebnou štěrbinu, místo hydrolýzy ATP. Pohyb domén umožňuje vznik otevřené a uzavřené konformace F-aktinu.

Pohyb domén je umožněn rotací kolem , znázorněné fialovou barvou. Podle Ody a spol. se předpokládá, že během přechodu z G- na F- aktin se doména 2 nakloní o 20° a zapadne do domény 1, čímž získá plošší konformaci než volný G- aktin. Není jisté, zda k tomuto zploštění dochází před nebo po hydrolýze ATP. Holmes poskytuje zjednodušený obraz tohoto pohybu a zploštění domény.

Stabilita

Zploštělá složená forma F-aktinu vyžaduje jiné stabilizační mechanismy než volná monomerní forma G-aktinu. Stabilita komplexu F-aktinu je dosažena řadou zahrnující arginin 206, 183, 177 (fialová); glutamát 72(modrá), aspartát 187(zelená), 179 a 4-methyl histidin 73(žlutá). Předpokládá se, že dodatečná stabilita vzniká přerušením interakce mezi zbytky ve stejné polovině jejich příslušných domén k nové interakci mezi nimi, kde je mezi nimi pozorována mnohem větší vzdálenost.

Po uvolnění Pi dochází ke konformační změně na D-smyčce, která má za následek „změkčení“ F-aktinového vlákna. To znamená, že se monomer ADP-aktinu stává nestabilnějším a je náchylnější ke štěpení

Aktivní místo

Po navázání aktinu na plusový konec aktinového vlákna se aktivuje funkce ATPázy. Konformační změna z G- na F- aktin podporuje katalytickou aktivitu díky 20° posunu vedoucímu k uzavřenějšímu vazebnému místu; tato konformační změna je stabilizována také diagonální subdoménovou interakcí mezi Leu110 a Thr194. V důsledku těchto konformačních změn je aktin posunut blíže k ligandu ATP-Ca2+. Gln137 drží molekulu vody a jeho umístění do těsné blízkosti ATP umožňuje štěpení gama-fosfátu. K uvolnění anorganického fosfátu dochází prostřednictvím konformační změny flexibilní „D-smyčky“ na uspořádaný alfa-helix (i když to tento model neprokazuje).

Funkce

F-aktin plní v eukaryotických buňkách strukturní, mechanickou a enzymatickou úlohu. Tyto funkce se nemusí nutně navzájem vylučovat.

Dynamické funkce f-aktinu se významně podílejí na migraci buněk.

Cytoskelet

F-aktin je nejrozšířenější složkou cytoskeletu eukaryot. Vzhledem ke své tenké velikosti poskytuje velké množství pevnosti v tahu. V případech, kdy není žádoucí jeho pružnost jako strukturní složky, lze mezi polymery F-aktinu vytvářet příčné vazby, které poskytují větší tuhost a oporu.

Prodloužení větví F-aktinu vede k jevu posouvání plazmatické membrány dopředu při lamelopodiálním a filopodiálním prodloužení. Tento proces je závislý na dynamickém rovnovážném stavu, v němž se nachází G- a F-aktin, protože právě neustálá polymerizace aktinových jednotek na předním okraji pohání prodlužování membrány. Bez enzymatické ATPázové funkce F-aktinu by tento proces nebyl možný.

Aktin-myosin

Relativně plošší tvar F-aktinu ve srovnání s G-aktinem umožňuje myosinu přednostně vázat F-aktin před G-aktinem. To znamená, že funkční formou aktinu je F-aktin, nikoli G-aktin. Tvoří velkou část tenkých vláken, která ve spojení s mysoinem vyvolávají svalové kontrakce. Struktura F-aktinu mu dává velkou odolnost vůči rozsáhlým silám, jaké vznikají například při svalové kontrakci

.