Elektroporace a konkurenční metody transfekce

Angelo DePalma Ph.D. Writer GEN

Protože je univerzální – pracuje s jakoukoli buňkou, s jakýmkoli organismem – je elektroporace jedinečně výhodná.

Elektroporace využívá elektrický impuls k zavedení nových druhů, obvykle polárních molekul, do buněk. Tato technika využívá slabých interakcí mezi fosfolipidovými dvojvrstvami, které udržují integritu buněčných membrán. V typické buněčné membráně jsou fosfolipidy uspořádány tak, že jejich polární hlavové skupiny směřují ven a hydrofobní ocasní skupiny dovnitř, což je uspořádání, které brání průchodu polárních molekul. Bez nějaké pomoci nemohou polární molekuly vstoupit dovnitř.

Když buňky zažijí řízený elektrický impuls, fosfolipidová vrstva se otevře a vytvoří dočasné fyzikální kanály, které umožní molekulám vstoupit dovnitř. Za správných podmínek se kanály rychle uzavřou a buňka se vrátí do původního stavu – až na to, že nyní obsahuje cizí molekuly.

Kromě přímého vnášení genů elektroporace usnadňuje přímý přenos plazmidů mezi buňkami nebo druhy – například z bakterií do kvasinek.

Pokračují rozsáhlé experimenty s využitím elektroporace pro dodávání léčiv a vakcín přímo do buněk živých organismů. Tento článek se zaměřuje na nemedicínské aplikace.

Elektroporace se nejčastěji používá k přechodné transfekci buněk, i když je možná i stabilní transfekce. V biofarmaceutickém průmyslu umožňuje přechodná transfekce produkci až několika gramů proteinu pro charakterizaci a preklinické studie. V této aplikaci se elektroporace s využitím plazmidů ukázala jako spolehlivá a předvídatelná. Elektroporace podobně vytváří stabilně transfekované buňky za předpokladu, že je DNA zavedena v linearizované formě po předchozím ošetření restrikčním enzymem.

Jedna z mnoha technik

Elektroporace je pevně zakotvena v arzenálu transfekčních technik, které zahrnují virové vektory, chemické metody nebo metody založené na činidlech a mechanické dodávání genů. Virové vektory jsou nejběžnější metodou pro vytváření stabilně transfekovaných buněk pro výrobu terapeutických proteinů. Virové vektory poskytují velmi vysokou účinnost transfekce, ale jsou omezené z hlediska délky vložené DNA. Virové vektory se také potýkají s problémy souvisejícími s biologickou bezpečností a mutagenezí.

Experimentálně se používají další mechanické techniky, jako je mikroprecipitace, mikroinjekce, lipozomy, bombardování částicemi, sonoporace, laserem indukovaná porace a transfekce kuličkami. Tyto mechanické techniky mají společné rysy. Narušují buněčné membrány a umožňují tak průnik DNA do buňky. Některé přístupy – například „genová zbraň“ – zahrnují projekci genů přímo přes membránu do cytoplazmy. Odtud mohou geny migrovat do jádra.

Dále existují hybridní techniky, které využívají možností mechanických a chemických transfekčních metod. V posledním desetiletí se například objevilo mnoho článků o magnetofekci, metodice transfekce, která kombinuje chemickou transfekci s mechanickými metodami. Například kationtové lipidy mohou být nasazeny v kombinaci s genovými pistolemi nebo elektroporátory. Většina literatury o magnetofekci se týká dodávání genů a terapeutických molekul do živých organismů.

Elektroporace má několik výhod: univerzálnost (pracuje s jakýmkoli typem buněk), účinnost, velmi nízké požadavky na DNA a schopnost pracovat v živých organismech. Mezi nevýhody patří možné poškození buňky a nespecifický transport molekul do buňky a z buňky.

Mezi chemickými, mechanickými a virovými transfekčními přístupy však samotná elektroporace poskytuje přiměřenou jistotu úspěchu bez ohledu na cílovou buňku nebo organismus.

Například chemická transformace a elektroporace jsou dvě hlavní metody vnášení DNA do Escherichia coli. U druhé jmenované metody musí být bakterie nejprve učiněny „kompetentními“ odstraněním pufrovacích solí, aby se zajistilo, že se proud dostane k buňkám, a poté musí být aplikován elektrický impuls při teplotě 0 °C, aby se snížilo poškození mikroorganismů. Chemická transformace zahrnuje suspenzi v CaCl2, která vytvoří póry, a následný tepelný šok, který vnese DNA do buněk.

Další přístup využívá kationtové lipidy k otevření buněčných membrán. Elektroporace je méně těžkopádná a účinnější, funguje na rozmanitějších typech buněk a snáze se přizpůsobuje standardním metodám než chemická transfekce. Někteří výzkumníci však dávají přednost chemické transformaci, protože nevyžaduje zakoupení přístroje.

Umožnění inovace

Ačkoli byla elektroporace poprvé popsána v roce 1965, stále otevírá cesty k inovativní vědě z hlediska přístrojů, protokolů a experimentů. Nejméně tucet univerzitních skupin vyvinulo elektroporační zařízení založená na mikroelektromechanických systémech (MEMS). Jednou z výhod mikrokanálových zařízení je, že mohou být navržena tak, aby na ně nebylo aplikováno větší napětí, než jaké postačuje k dosažení přiměřené inkorporace makromolekul. Tato výhoda je zároveň nevýhodou. Na rozdíl od komerčních elektroporačních systémů čipy nefungují se všemi buňkami.

Skupina z katedry biomedicínského inženýrství na Louisiana Tech University pod vedením doktora Shengniana Wanga zjistila, že nanočástice zlata zvyšují výkon komerčních elektroporačních zařízení.1 Wang se domnívá, že částice, které jsou vysoce vodivé, snižují vodivost buněčného média a zároveň fungují jako „virtuální mikroelektrody“, které pomáhají otevírat fosfolipidové membrány. Tvrdí, že díky nižším porézním napětím se zvyšuje výkonnost (lepší účinnost přenosu DNA) a životaschopnost buněk.

Výzkumníci na Charité Universitätsmedizin Berlin2 vyvinuli kombinovanou čtvercovou pulzní elektroporační strategii pro reprodukovatelnou transfekci buněk. Doktorka Britta Siegmundová a její spolupracovníci zavěsí buňky do pufru a vystaví je počátečnímu vysokonapěťovému pulzu, po němž následuje nízkonapěťový pulz s různou elektrickou a časovou hodnotou. Dr. Siegmundová tvrdí, že životaschopnost je srovnatelná se standardní elektroporací a že účinnost transfekce dosahuje až 95 %. Dochází k závěru, že tato technika může být „snadno přizpůsobena pro buňky považované za obtížně transfekovatelné.“

Kromě běžného přenosu DNA byla transfekce použita pro zavedení interferující RNA do různých typů buněk. Tato technika umožňuje kontrolované studium dávkování a účinnosti dodávky v malém měřítku. Problémy s dávkováním a doručováním sužovaly praktické aplikace RNA interference v terapii. Ale přinejmenším jedna studie si položila otázku, zda jsou RNA interferenční geny nejúčinněji vnášeny pomocí transfekčních činidel nebo elektroporací do primárních buněk.3

Kirsty Jensen, Ph.D., a její kolegové z University of Edinburgh porovnávali účinnost 11 sad transfekčních činidel a elektroporace pro umlčení imunomodulačního genu středomořské horečky (MEFV) v makrofázích odvozených od hovězích monocytů. Skupina testovala metodiky pro vychytávání malé interferující RNA, vyřazení cílového genu, buněčnou toxicitu a indukci odpovědi interferonu typu I.

Elektroporace byla přibližně stejně účinná při vyřazování MEFV jako transfekční činidla. Na rozdíl od činidel elektroporace nevyvolala žádnou interferonovou odpověď, ale životaschopnost buněk byla nižší. Otázky životaschopnosti a účinnosti transfekce u elektroporace jsou obecně brány jako nominální hodnocení techniky.

Dr. Jensen došel k závěru, že „použití transfekčních činidel je pro naši práci zkoumající úlohu genů hostitelských makrofágů v reakci na infekci vhodnější než elektroporace“, ale že „volba transfekce nebo elektroporace malé interferující RNA do buněk závisí na jednotlivých experimentech.“

Přinejmenším v některých případech, kdy jsou výsledky elektroporace suboptimální, badatelé zanedbali optimalizaci jiných podmínek než sílu elektrického impulzu. Jak nedávno poznamenali Hu a spolupracovníci,4 účinnost elektroporace je ovlivněna neelektrickými faktory, jako je typ buňky nebo tkáně a složení DNA.

Elektroporace se stala nepostradatelnou metodou pro vývojovou biologii in vitro i in vivo. Velká část této práce probíhá v jednotlivých buňkách, což přispívá k modelu, který je velmi zajímavý pro terapii, diagnostiku, dodávání léčiv a buněčnou biologii. Přímá nanoporace jednotlivých buněk je obtížná kvůli nejistotě spojené s životaschopností po poraci.

Výzkumníci z Northwestern University vyvinuli techniku pro jednotlivé buňky, která zajišťuje vysokou životaschopnost a účinnost.5 Jejich přístup využívá mikrofabrikované konzolové zařízení, nanofonní sondu (NFP). Ta dodává molekuly do buněk šetrněji než objemová mikroinjekce nebo nanoporace. Badatelé prokázali elektroporaci jednotlivých HeLa buněk pomocí NFP s účinností transfekce lepší než 95 %, životaschopností 92 % a kvalitativní kontrolou dávkování.

NFP představují zlepšení oproti starším transfekčním technologiím využívajícím sondy pro mikroskop atomárních sil. Techniky založené na mikroskopii atomárních sil často způsobují ztrátu přilnavosti buněk nebo jejich roztržení. NFP způsobuje menší poškození buněk.