Elektroakupunktura zmírňuje oxidační stres jater a ledvin u anestezovaných potkanů

13 -PŮVODNÍ ČLÁNEK
METABOLISMUS

Elektroakupunktura tlumí oxidační stres jater a ledvin u anestetizovaných potkanů1

Eletroakupuntura atenua o estresse oxidativo no fígado e no rim em ratos anestesiados

Agamenon Honório SilvaI; Lanese Medeiros FigueiredoI; Paulo Araujo DiasI; Alberico Ximenes do Prado NetoII; Paulo Roberto Leitão de VasconcelosIII; Sérgio Botelho GuimarãesIV

IFellow Master Degree, Department of Surgery, Postgraduate Program, UFC, Ceara, Brazílie. Technické postupy, získávání a interpretace dat. Článek je součástí magisterské diplomové práce (AHS)
IIStudent postgraduálního studia, UFC, Ceara, Brazílie. Pomáhal s technickými postupy, získáváním dat
IIIPhD, docent, koordinátor postgraduálního programu, katedra chirurgie, UFC, Ceara, Brazílie. Kritická revize a interpretace dat
IVPhD, docent, katedra chirurgie, vedoucí, LABCEX, UFC, Ceara, Brazílie. Školitel, koncepce, design, intelektuální a vědecký obsah studie, psaní rukopisu, statistická analýza

Korespondence

ABSTRAKT

Cíl: Zkoumat účinky jednoho elektroakupunkturního (EA) sezení v akupunkturních bodech Zusanli (ST-36) a Zhongwan (CV-12) v kombinaci při regulaci oxidačního stresu v játrech a ledvinách u anestezovaných potkanů.
Metody: Osmnáct zdravých potkanů náhodně rozdělených do 3 skupin (n=6) bylo intraperitoneálně anestetizováno ketaminem (90mg kg-1 tělesné hmotnosti) + xylazinem (10mg/kg tělesné hmotnosti): G-1: kontrola (anestezie), G-2: anestezie+EA10Hz a 10 mA, 10 Hz) aplikované na pravé akupunkturní body ST-36 a CV-12 po dobu 30 minut. Podobně byl ošetřen i bod G-3, kde byla použita desetkrát vyšší frekvence (100 Hz). Aktivita G6PDH, hladiny malondialdehydu (MDA) a glutathionu (GSH) byly stanoveny spektrofotometricky.
Výsledky: Koncentrace MDA a GSH v játrech se u potkanů vystavených působení EA 10 Hz (p<0,01) a EA 100 Hz (p<0,001) ve srovnání s kontrolní skupinou G-1 významně zvýšily. Aktivita G6GPH v játrech a ledvinách se významně snížila u potkanů G-2 (p<0,01) a G-3 (p<0,001) ve srovnání s G-1 v EA100Hz. Podobný průběh byl zjištěn u aktivity G6PDH v ledvinách u potkanů EA10Hz.
Závěr: Jednorázové 30minutové sezení EA 10/100Hz zvyšuje peroxidaci lipidů a současně snižuje oxidační stres v jaterních a ledvinových tkáních na modelu potkanů.

Klíčová slova: EA 10/100Hz zvyšuje peroxidaci lipidů a současně snižuje oxidační stres v jaterních a ledvinových tkáních: Akupunktura. Elektroakupunktura. Peroxidace lipidů. Oxidační stres. Rats.

RESUMO

OBJETIVO: Investigar os efeitos de uma única sessão de eletroacupuntura (EA) aplicada nos acupontos Zusanli (E-36) e Zhongwan (RM-12) simultaneamente, on regulação do estresse oxidativo no fígado e rins em ratos anestesiados.
METODY: Osmnáct zdravých potkanů, náhodně rozdělených do tří skupin (n = 6), bylo anestetizováno ketaminem (90 mg/kg tělesné hmotnosti) + xylazinem (10 mg/kg tělesné hmotnosti): G-1: kontrola (anestezie), G-2: anestezie + EA10Hz a G-3: anestezie + EA100Hz. Krysy ve skupině G-2 byly podrobeny EA (pulzní čtvercové vlny, 10 mA, 10 Hz) aplikované na pravé akupunkturní body ST-36 a VC-12 po dobu 30 minut. U potkanů ze skupiny G-3 byla použita desetkrát vyšší frekvence (100 Hz). Aktivita enzymu G6PDH a koncentrace malondialdehydu (MDA) a glutathionu (GSH) byly kontrolovány spektrofotometricky.
Výsledky: Koncentrace MDA a GSH v játrech se významně zvýšily u potkanů vystavených AE s použitím 10 Hz (p <0,01) a 100 Hz (p <0,001) ve srovnání s kontrolou. Aktivita G6GPH byla u potkanů léčených 100 Hz významně snížena v játrech a ledvinách skupin G-2 (p <0,01) a G-3 (p <0,001) ve srovnání se skupinou G-1.
ZÁVĚR: Jednorázové 10/100Hz sezení EA po dobu 30 minut zvyšuje peroxidaci lipidů a současně snižuje oxidační stres v játrech a ledvinách zdravých potkanů.

Popisné údaje: Akupunktura. Elektroakupunktura. Peroxidace lipidů. Oxidační stres.

Úvod

Manuální akupunktura (MA) je jednou z hlavních forem léčby v tradiční čínské medicíně. Při ní se používají ostré tenké jehly, které se zavádějí do těla ve velmi specifických bodech (akupunkturních bodech). MA se v orientálních zemích používá již několik tisíciletí a je stále více přijímána lékaři a pacienty i na Západě1. Elektroakupunktura (EA) je modifikací této techniky, při níž se na jehly předem zavedené do těla aplikují malé elektrické proudy, a zdá se, že v mnoha specifických klinických a výzkumných podmínkách dosahuje konzistentněji reprodukovatelných výsledků2-4. EA aplikovaná na akupunkturu Zusanli (ST-36) snížila peroxidaci lipidů v experimentálních modelech ischemie/reperfuze, jako je mícha potkana5, mozek6 a krevní sérum7 a prasečí srdeční sval8.

Chakrabarti et al.9 zkoumali účinek jednorázové, akutní (7 pulzů/sec., 0,75 V) a chronické (4 pulzy/sec., 0,75 V) elektroakupunktury ve střídavých dnech po dobu 21 dnů na jaterní funkce potkanů. Byly použity dva akupunkturní body na zádech spolu s bodem ST-36. Po chronické léčbě se významně snížila hodnota jaterní mikrosomální peroxidace lipidů. Navíc vzhledem k tomu, že manuální stimulace akupunktu ST-36 je schopna zmírnit poškození ledvin vyvolané sepsí10, je možné, že elektrická stimulace tohoto akupunktu může změnit koncentraci MDA, ukazatele poškození buněčných membrán, v ledvinové tkáni.

Fyziologické procesy jsou regulovány enzymy. NADPH je hlavním intracelulárním reduktantem a jeho produkce je závislá především na glukózo-6-fosfátdehydrogenáze. Pokud je aktivita G6PDH inhibována, dochází současně k poklesu aktivity NADPH, koenzymu, který je nezbytný pro ochranu před oxidačním poškozením. Integrita buněk i celý antioxidační systém závisí na dostatečném přísunu NADPH11. Mnoho prací prokázalo účinky MA a EA na akupunkturu ST-36 při tlumení oxidačního stresu u různých experimentálních onemocnění5-9. Navíc použití ketaminu+xylazinu, anestetické směsi často používané v experimentálních studiích, může u zdravého zvířete vyvolat určitý stupeň oxidačního stresu12-13.

Již dříve bylo prokázáno, že při stimulaci akupunkturních bodů CV-12 pomocí 2 Hz se z nadledvinek vylučuje velké množství endogenních opioidních peptidů14. Když byl ke stimulaci akupunktu CV-12 použit vysokofrekvenční EA (15 Hz), bylo zjištěno více zdrojů endogenních opioidních peptidů15. Proto bylo naším cílem zjistit, zda aplikace EA stimulující akupunkturní body ST36 a CV-12 pomocí dvou různých frekvencí, 10 Hz a 100 Hz, může modifikovat obsah MDA a GSH v játrech a ledvinách a zda existuje rozdíl v peroxidaci lipidů a oxidačním stresu mezi EA 10 Hz a 100 Hz u zdravých hlodavců.

Metody

Příprava zvířat

Samci potkanů Wistar o hmotnosti 280-400 g, které poskytlo zařízení pro chov malých zvířat lékařské fakulty (Federal University of Ceara), byli chováni v kontrolovaných podmínkách prostředí (24 °C _relativní vlhkost 40-60 %, 12hodinové střídavé cykly světlo-tma, potrava a voda ad libitum). Pro jehličkování a elektrickou stimulaci byly vybrány ekvivalenty lidských pravých akupunktur ST-36 a CV-12. Použitá nomenklatura akupunkturních bodů se řídí nomenklaturou WHO16. Akupunkturní bod ST-36 se nachází 5 mm pod hlavičkou fibuly pod kolenním kloubem a 2 mm laterálně od předního tuberkulu tibie. Punkce akupunktu ST-36 stimuluje laterální surální kožní nerv, kožní větev podkolenního nervu a hlouběji hluboký peroneální nerv17-18 . Akupunkturní bod CV-12 se nachází v přední střední čáře horní části břicha, 20 mm pod sternální synchondrózou. Tato oblast je inervována přední kožní větví 8. mezižeberního nervu18.

Materiály

Použity byly jednorázové jehly z nerezové oceli (0,20×30 mm, 0,5 cm, DongBang Acupuncture Inc., Chung Nam, Korea). Elektrostimulátor EL-608 byl zakoupen od společnosti NKL Produtos Eletrônicos Ltda., Brusque, Santa Catarina, Brazílie.

Experimentální skupiny

Zvířata byla anestetizována intraperitoneálně čerstvě připravenou směsí ketaminu (90 mg kg/tělesnou hmotnost) a xylazinu (10 mg kg/tělesnou hmotnost). Potkani byli náhodně rozděleni do 3 stejných skupin takto:

* Skupina 1 (anestezie) – 6 potkanů

* Skupina 2 (EA 10Hz) – 6 potkanů

* Skupina 3 (EA 100Hz) – 6 potkanů

Skupina 1 (kontrola) potkani byli anestetizováni, jak je popsáno. Po šedesáti minutách bylo potkanům otevřeno břicho a vyjmuta játra a pravá ledvina. Potkani skupiny 2 (EA10Hz) byli anestetizováni podle popisu. Po běžné dezinfekci kůže 75 % etanolem byly do pravých akupunkturních bodů ST-36 a CV-12 kolmo zavedeny jednorázové jehly z nerezové oceli (0,25 mm × 30 mm) v hloubce 2-3 mm. Elektrody byly připojeny k oběma jehlám a k elektrostimulátoru (NKL EL-608); pulzní čtvercové vlny, 10 Hz, 10 mA byly aplikovány po dobu 30 minut. Vzorky byly odebrány o 30 minut později. Potkani skupiny 3 (EA100Hz) byli podrobeni EA jako skupina 2. Byla však použita desetkrát vyšší frekvence (100 Hz).

Biochemická stanovení

Stanovené parametry zahrnovaly aktivitu G6PDH, koncentrace malondialdehydu (MDA) a glutathionu (GSH). Vzorky tkání byly rychle zmraženy v tekutém dusíku a uloženy ve skleněných zkumavkách při -70º až do následné přípravy a analýzy homogenátů jater a ledvin. Peroxidace lipidů byla stanovena měřením malondialdehydu jako látky reagující s TBA19. Stručně řečeno, k 10% homogenátu (0,5 ml) byl přidán H3PO4 (1 %, 3 ml) a vodný roztok TBA (0,6 %, 3 ml). Testovací médium se protřepalo a zahřívalo na vroucí vodní lázni po dobu 45 min. Po ochlazení byly přidány 4 ml n-butanolu a směs byla protřepána. Po oddělení n-butanolové vrstvy odstřeďováním při 1200 g po dobu 15 min byla stanovena její optická hustota ve spektrofotometru (Beckman DU 640 B; Beckman Instruments, nyní Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA) s vlnovými délkami 535 a 520 nm jako absorpčními. Rozdíl mezi výsledky obou stanovení optické hustoty byl brán jako hodnota TBA a bylo vypočteno množství malondialdehydu (MDA) ve varleti, porovnáno se standardy MDA a vyjádřeno jako mikromoly MDA na gram vlhké tkáně. Hladina GSH byla odhadnuta metodou Sedlaka a Lindsaye20 , která je založena na reakci mezi thiolovými skupinami a 5-5-dithiobis-(2-nitrobenzoovou kyselinou) za vzniku sloučeniny, která absorbuje světlo při 412 nm. Množství GSH bylo stanoveno ze standardní křivky získané současně za stejných podmínek s různými koncentracemi GSH. Aktivita G6PDH byla odhadnuta metodami popsanými dříve21. Aktivita enzymu byla odečtena spektrofotometricky.

Analýza dat

Pro výpočty a statistickou analýzu byl použit GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com). Všechny výsledky byly vyjádřeny jako průměr±SD. Všechny údaje byly testovány na rozdělení (Kolmorogov-Smirnovův test s Dallal-Wilkinson-Lilliefor P hodnotou). Pro stanovení rozdílů mezi skupinami v koncentracích MDA a GSH a v aktivitě G6PDH v jaterní a ledvinové tkáni byla podle potřeby provedena jednosměrná ANOVA nebo Kruskal-Wallisův test. Při post hoc analýze (Tukey nebo Dunn) byla za statistickou významnost považována hodnota pravděpodobnosti p<0,05.

Výsledky

Test GSH

Koncentrace GSH v játrech se u potkanů vystavených EA 10Hz a EA 100Hz významně zvýšila (p<0,001) ve srovnání s kontrolou (obr. 1). K podobnému zvýšení koncentrací GSH v ledvinách došlo u skupin EA10Hz i EA100Hz (obr. 2). Kromě toho se koncentrace GSH v játrech a ledvinách významně zvýšily u potkanů vystavených působení EA100Hz ve srovnání se skupinou EA10Hz.

MDA Assay

Koncentrace MDA v játrech se významně zvýšily u potkanů vystavených působení EA10Hz (p<0,01) a EA100Hz (p<0,001), ve srovnání s kontrolní skupinou (Obrázek 3). K podobnému zvýšení koncentrací MDA v ledvinách došlo u obou skupin EA10Hz a EA100Hz (obr. 4). Koncentrace MDA v ledvinách se významně zvýšily ve skupině EA100Hz ve srovnání se skupinou EA10Hz.

G6PDH Assay

Aktivita G6GPH v játrech se významně snížila ve skupinách EA100Hz (p<0,001) ve srovnání s kontrolní skupinou (obr. 5). Podobný průběh byl zjištěn i u aktivity G6PDH v ledvinách u potkanů EA10Hz. Aktivita G6PDH v ledvinách se v obou skupinách nelišila (obr. 6).

Diskuse

V našem experimentu byl oxidační stres vyvolán použitím ketaminu, disociativního anestetika, které se často používá buď při veterinárních zákrocích, nebo pro experimentální účely. Alva a spol.12 prokázali, že ketamin vede ke zvýšení plazmatické hladiny oxidu dusnatého, vyvolává metabolickou acidózu a způsobuje oxidační poškození, aniž by však dosáhl jaterní toxicity.

Byly prokázány antioxidační účinky nízkofrekvenčního EA. Siu a spol.6 elektrostimulovali akupunkturní body GB-20, který se nachází na zadní straně krku pod týlní kostí, v prohlubni mezi sternocleidomastoidním svalem a trapézovým svalem a ST-36, pomocí několikanásobné aplikace před mozkovou ischémií a dospěli k závěru, že 2Hz EA může částečně regulovat peroxidaci lipidů při mozkové ischémii. GB-20 a ST-36 měly podobnou příznivou účinnost6. V naší studii vyvolalo použití EA významné zvýšení koncentrace MDA v játrech (obr. 3) a ledvinách (obr. 4) ve skupinách EA10Hz a EA100Hz. K dalšímu zvýšení peroxidace lipidů došlo u skupiny EA100Hz ve srovnání s potkany EA10Hz. To naznačuje, že ledviny jsou k peroxidaci lipidů náchylnější než játra. Zdá se, že použití elektrické stimulace s využitím vysokých frekvencí v jednom sezení zvyšuje peroxidaci lipidů u tohoto modelu potkanů.

Yu et al.22 hodnotili úlohu jehlové stimulace čtyř různých akupunkturních bodů:

Když jsme studovali účinky jediného elektroakupunkturního sezení, zatímco v Yu et al.22 hodnotili účinky klasické akupunkturní léčby prováděné dvakrát denně po dobu 14 dnů, se domníváme, že za zvýšení hladiny MDA může být zodpovědné použití elektrické stimulace v rámci jednoho sezení. Na druhou stranu EA použitá v jednom sezení vyvolala významné zvýšení koncentrace GSH v jaterní (obr. 1) i ledvinné (obr. 2) tkáni. Ochranný účinek EA je větší při vyšších frekvencích, jak ukazuje zvýšená koncentrace GSH v ledvinách potkanů s frekvencí EA100 Hz ve srovnání se zvířaty s frekvencí EA10 Hz.

G6PDH hraje velmi důležitou roli v reakci buněk na oxidační stres. Donedávna panoval obecný názor, že význam tohoto enzymu je omezen na lidské erytrocyty, které postrádají jinou cestu produkující NADPH23. Nedávná pozorování ukázala, že G6PDH hraje ochrannou roli proti reaktivním formám kyslíku v eukaryotických buňkách, které mají alternativní cesty pro produkci NADPH24. V této studii se aktivita G6PDH významně snížila v játrech skupin EA10Hz a EA100Hz. Podobný pokles aktivity byl pozorován i v ledvinách potkanů EA10Hz. Koncentrace GSH v ledvinách se u EA100Hz potkanů zvýšila v době, kdy byl u téže skupiny prokázán současný pokles G6PDH.

Yu a spol.25 prokázali, že aktivace G6PDH je nepřímo úměrná intracelulární hladině GSH, přičemž využili buněčné suspenzní kultury Taxus chinensis. Je možné, že živočišné buňky by se mohly chovat podobně.

Co se týče silných a slabých stránek této studie ve vztahu k ostatním, neexistuje žádná publikovaná studie, kterou by bylo možné přímo porovnat s tímto výzkumem. Navzdory tomu, že zde byly prokázány peroxidační účinky EA, na rozdíl od jiných studií6 , nebyla 10 Hz elektrostimulace jinými výzkumníky použita. Publikované studie používaly nízkofrekvenční EA (2 Hz), a to ve více sezeních. V naší studii bylo využito jediné sezení. Na druhou stranu pokles aktivity G6PDH v játrech a ledvinách potkanů ošetřených 100 Hz, resp. 10 Hz, spolu se současným zvýšením hladiny GSH po jednom sezení EA naznačují, že vyšší frekvence by mohly navodit lepší ochranu proti oxidačnímu stresu. Mechanismy, které se na tom podílejí, nejsou zatím jasné. Další studie mohou vrhnout nové světlo na ochranné účinky elektroakupunktury.

Závěr

Shromážděné údaje podporují hypotézu, že jediné 30minutové sezení EA 10/100 Hz zvyšuje peroxidaci lipidů a současně snižuje oxidační stres zvýšením hladiny GSH v jaterních a ledvinových tkáních na modelu potkanů.

1. Campbell A. Počátky akupunktury. Acupunct Med. 2002;20(2-3):141

6. Siu FK, Lo SC, Leung MC. Účinnost vícenásobné preischemické elektroakupunktury na útlum peroxidace lipidů vyvolané mozkovou ischémií u dospělých potkanů. Life Sci. 2004;75(11):1323-32.

8. Wang XR, Xiao J, Sun DJ. Myokardiální ochranné účinky elektroakupunktury a hypotermie na prasečí srdce po ischemii/reperfuzi. Acupunct Electrother Res. 2003;28(3-4):193-200.

12. Alva N, Palomeque J, Carbonell T. Oxid dusnatý navozený anestezií ketaminem/xylazinem udržuje průtok krve játry během hypotermie. Oxid dusnatý. 2006;15(1):64-9.

14. Lin JG, Chang SL, Cheng JT. Uvolňování beta-endorfinu z nadledvinek ke snížení plazmatické glukózy elektroakupunkturou u akupunktury Zhongwan u potkanů. Neurosci Lett. 2002;326(1):17-20.

15. Lin JG, Chen WC, Hsieh CL, Tsai CC, Cheng YW, Cheng JT, Chang SL. Více zdrojů endogenního opioidního peptidu podílejících se na hypoglykemické odpovědi na 15 Hz elektroakupunkturu v akupunktuře Zhongwan u potkanů. Neurosci Lett. 2004;366(1):39-42.

16. Světová zdravotnická organizace (WHO). Standardní akupunkturní nomenklatura: stručný výklad 361 klasických akupunkturních bodů a jejich vícejazyčný srovnávací seznam. 2ed. Regionální úřad WHO pro západní Pacifik; 1993.

23. Xu Y, Osborne BW, Stanton RC. Diabetes způsobuje inhibici glukóza-6-fosfát dehydrogenázy prostřednictvím aktivace PKA, která přispívá k oxidačnímu stresu v kůře ledvin potkanů. Am J Physiol Renal Physiol. 2005;289(5):F1040-7.

24. Salvemini F, Franzé A, Iervolino A, Filosa S, Salzano S, Ursini MV. Zvýšená hladina glutathionu a oxidorezistence zprostředkovaná zvýšenou expresí glukózo-6-fosfátdehydrogenázy. J Biol Chem. 1999;274(5):2750-7.

25. Yu LJ, Lan, WZ, Chen C, Yang Y. Hladiny glutathionu kontrolují aktivitu glukózo-6-fosfát dehydrogenázy během oxidačního stresu vyvolaného elicitory v buněčných suspenzních kulturách Taxus chinensis. Plant Sci. 2004;167:329-35.