Echovirus 4 spojený s onemocněním rukou, nohou a úst

VIROLOGIE

Echovirus 4 spojený s onemocněním rukou, nohou a úst

Echovirus 4 associado à doença de mão, pé e boca

Denise Hage Russo; Adriana Luchs; Bráulio Caetano Machado; Rita de Cássia Carmona; Maria do Carmo Sampaio Timenetsky

Enteric Viruses Laboratory, Adolfo Lutz Institute, São Paulo, SP, Brazil

Korespondence

SUMMARY

Onemocnění rukou, nohou a úst (HFMD) je nakažlivá enterovirová infekce vyskytující se především u dětí a charakterizovaná vezikulárními palmoplantárními erupcemi a erozivní stomatitidou. Echovirus 4 (EV-4) je běžně spojován s aseptickou meningitidou. Souvislost HFMD s EV-4 nebyla dosud hlášena. Dva vzorky 14měsíčního dítěte, které mělo mírnou horečku, vředy v ústech, vyrážku s puchýři na dlaních a chodidlech, byly zaslány do laboratoře enterických virů Institutu Adolfa Lutze. Klinické vzorky byly inokulovány do tří různých buněčných linií a ty, které vykazovaly cytopatický účinek (CPE), byly podrobeny nepřímému imunofluorescenčnímu testu (IFA) a „one step“ RT-PCR. Elektroforéza v agarózovém gelu z produktu RT-PCR ukázala produkt o 437 bp, který je charakteristický pro skupinu enterovirů. Echovirus 4 byl identifikován pomocí IFA. Ačkoli HFMD je virová infekce spojená především s Enterovirem 71 (HEV-71) a Coxsackievirem A16 (CV-A16), naše výsledky ukazují rozmanitost sérotypů souvisejících s HFMD a zdůrazňují význam epidemiologického sledování tohoto onemocnění a jeho komplikací.

Klíčová slova:

RESUMO

A Doença de Mão, Pé e Boca (DMPB) é uma infecção enteroviral contagiosa que ocorre principalmente em crianças sendo caracterizada por erupções palmoplantares vesiculares e estomatite. Echovirus 4 (EV-4) é comumente associado a meningite asséptica. Asociace DMPB s EV-4 nebyla dosud popsána. Dva vzorky od 14měsíčního dítěte s horečkou, sekrecí z krku a vyrážkou na dlaních a chodidlech byly zaslány do laboratoře enterických virů Instituto Adolfo Lutz. Vzorky byly inokulovány do tří různých buněčných linií; ty, které vykazovaly cytopatický účinek (CPE), byly podrobeny nepřímému imunofluorescenčnímu testu (IFI) a „one step“ RT-PCR. Elektroforéza v agarózovém gelu provedená s produktem PCR ukázala produkt o velikosti 437 pb, charakteristický pro skupinu enterovirů. Sérotyp EV-4 byl identifikován pomocí IFI. Ačkoli je DMPB virovou infekcí spojenou především s enterovirem 71 (HEV-71) a coxsackievirem A16 (CV-A16), naše výsledky zdůrazňují potřebu epidemiologických a laboratorních studií zaměřených na EV-4 jako původce DMPB.

ÚVOD

Onemocnění rukou, nohou a úst (HFMD) je běžné onemocnění kojenců a dětí mladších 10 let a je charakterizováno horečkou, vředy v ústech a vyrážkou s puchýři. HFMD začíná mírnou horečkou, nechutenstvím, malátností a často bolestmi v krku. Jeden nebo dva dny poté se objeví horečka a vznik vřídků v ústech. Běžně se objevují malé červené skvrny s puchýři, které se stávají vředy. Obvykle se nacházejí na jazyku, dásních a uvnitř tváří. Kožní vyrážka se vyvíjí v průběhu 1-2 dnů s plochými nebo vyvýšenými červenými skvrnami a některými s puchýři. Vyrážka nesvědí a obvykle se nachází na dlaních a chodidlech. Objevuje se také na hýždích. I když některé osoby s HFMD mohou mít pouze vyrážku nebo vředy v ústech4.

K přenosu dochází z člověka na člověka přímým kontaktem s výtoky z nosu a krku nebo fekálně orální cestou. HFMD se nepřenáší na domácí zvířata ani z jiných zvířat. Jednotlivé případy HFMD se vyskytují celosvětově, častěji v létě a na začátku podzimu4. Dochází také k vertikálnímu šíření z matky na plod, ale případy se vyřeší bez dlouhodobých komplikací, infekce v prvním trimestru může vést ke spontánnímu potratu nebo intrauterinní růstové retardaci. Byly hlášeny další komplikace včetně myokarditidy, meningoencefalitidy, plicního edému a dokonce úmrtí16.

První zprávu o HFMD vypracoval ROBINSON & RHODES v roce 195812. Hlásili exantém s přidruženou horečkou a lézemi v dutině ústní, zaznamenaný u více než 60 osob v červnu a červenci 1957 v kanadském Torontu. Coxsackievirus A16 (CV-A16) byl izolován ze dvou třetin z 27 studovaných vzorků stolice. Další hlášená epidemie Coxsackieviru se vyskytla v Birminghamu v Anglii v létě 1960 a popsali ji ALSOP a spol.2 , kteří zaznamenali vezikulární léze na rukou a nohou s orofaryngeálními lézemi a kteří tuto erupci nazvali nemocí rukou, nohou a úst16.

HFMD je způsobena enteroviry, členy rodiny pikornavirů (jednovláknová RNA, neobalená), a nejčastěji je spojena s CV-A16 nebo enterovirem 71 (HEV-71). Ojediněle byly hlášeny také případy spojené s CV-A4 až CV-A7, CV-A9, CV-A10, CV-B1 až CV-B3 a CV-B5. Infekce jsou obvykle sporadické, ale pravidelně dochází k epidemiím. Počáteční virová infekce je na bukální a ileální sliznici a následuje rozšíření do regionálních lymfatických uzlin během 24 hodin. Rychle následuje virémie a virus se šíří na ústní sliznici a kůži. Přibližně 7. den po infekci se může začít zvyšovat hladina protilátek v séru 6,8.

PATENTI A METODY

Vzorky: V průběhu července 2003 došlo k propuknutí HFMD ve středisku denní péče ve městě São Paulo a dva vzorky stolice 14měsíčního dítěte mužského pohlaví s podezřením na tento případ byly zaslány do laboratoře enterálních virů Institutu Adolfa Lutze. Chlapec měl horečku, vředy v ústech, malátnost, nechutenství a vyrážku na dlaních a chodidlech. Dalších osm dětí z téhož centra v rozmezí od 10 měsíců do tří let mělo podobné příznaky. HFMD byla diagnostikována i v jiných zdravotnických centrech (osobní sdělení). Nebylo možné odebrat párové vzorky séra, aby bylo možné přistoupit k sérologickým testům k titraci protilátek.

Izolace a identifikace virů: Vzorky odebrané během šesti dnů od lap, byly vyčištěny při centrifugaci při 10 000 x g/60 minut, při 4 ºC; byla přidána antibiotika (streptomycin a penicilin ) a supernatant byl skladován při -70 ºC až do inokulace (0,1 a 0,2 ml/zkumavka) na tři různé buněčné linie: RD (lidský rhabdomyosarkom), HEp 2 (lidský epidermální karcinom hrtanu) a Vero (zelené opičí ledviny) obsahující minimální esenciální médium (Eagle’s L15, Eagle’s + AANE + piruvate a 199 medium). Poté byly zkumavky uchovávány při teplotě 35-37 °C. Kultury byly každý den pozorovány pod inverzním mikroskopem, aby se zviditelnil cytopatický účinek (CPE). Postupné pasáže naočkovaného materiálu byly prováděny, dokud se neobjevil nebo neobjevil charakteristický CPE infekce HEV7.

Přímý imunofluorescenční test – IFA: Když buněčná kultura vykazovala alespoň 75 % CPE, byla seškrábnuta ze zkumavky a buněčná suspenze byla nanesena na skleněné sklíčko, které bylo vysušeno na vzduchu a fixováno acetonem. Poté byla provedena nepřímá imunofluorescenční analýza (IFA) s použitím specifických monoklonálních protilátek, které jsou komerčně dostupné (Chemicon International Inc., Temecula, CA/USA) pro rod, skupinu a sérotypy HEV. Jamky se sklíčky byly vyšetřeny pod epifluorescenčním mikroskopem3.

RT-PCR: Virová RNA byla z izolovaného viru extrahována pomocí Trizol® LS (Invitrogen, kat. č. 1296-010) a chloroformu podle pokynů výrobce. Po odstředění při 12 000 xg byla oddělena vodná fáze a provedeno vysrážení isopropylalkoholem. Pelet RNA byl promyt 75% ethanolem. Na konci postupu byla RNA krátce vysušena a resuspendována vodou Milli-Q; přidán RNAsin a RNA uložena při -70 ºC. Z extrahované RNA a směsi byla syntetizována cDNA: 50 mM MgCl2; 10x PCR pufr; 1,25 nM dNTP; 20 µM/µL primer AS1/S1; 2 µL Super Script II RNAse Reverse Transcriptase; 2,5 U/µL TaqQ DNA Polymerase; 40 U/µL RNAsin a Milli-Q voda. Amplifikační reakce byly provedeny v termocykleru Gene Amp PCR System 9600 Perkin Elmer s následujícím programováním: (42 ºC/1h) + (95 ºC/5 min) + 25 cyklů (94 ºC/1 min + 50 ºC/2 min + 72 ºC/1min) + (72 ºC/7min). Produkty PCR byly separovány na 1,5% agarózovém gelu, obarveny ethidium bromidem a vizualizovány pod UV světlem. Primery namířené na 5’nepřekládanou oblast amplifikovaly produkt o velikosti 437bp13.

VÝSLEDKY

CPE naznačující HEV: zakulacení, smrštění, jaderná pyknóza, lomivost a degenerace buněk byly citlivé na RD a Vero buňky. Doba do nahlášení pozitivní kultivace byla přibližně 4-7 dní.

Pod epifluorescenčním mikroskopem bylo možné při zvětšení 400x pozorovat jasnou jablečně zelenou fluorescenci v jádře a/nebo cytoplazmě buněk, což svědčilo o pozitivní reakci na sérotyp echoviru 4. V případě, že se jednalo o echovirus 4, byla reakce pozitivní. IFA byla negativní na ostatní monoklonální protilátky.

K potvrzení rodu HEV byla použitaRT-PCR. Elektroforéza v agarózovém gelu ukázala produkt o velikosti 437 bp, který identifikoval HEV (obr. 1).

DISKUSE

Etiologickým původcem identifikovaným v této studii je HEV, který se liší od ostatních dříve souvisejících s HFMD. Tento syndrom byl běžně spojován s CV-A16 a HEV-71, zatímco o EV-4 spojeném s HFMD nebyly v literatuře nalezeny žádné epidemiologické údaje.

Mimochodem epidemie HFMD, ke které došlo v Malajsii (1997), byla spojena s EV-1, CV-A9 a HEV-711. HFMD způsobená HEV-71 byla spojena se smrtelnými případy encefalitidy během ohnisek v Malajsii (1997) a na Tchaj-wanu (1998)17. V druhé polovině roku 2000 byl kromě CV-A16 a EV-7 jako etiologické agens HFMD zjištěn i EV-75. V Brazílii MOREIRA et al. (1995) uvedli epidemické exantémové onemocnění spojené s coxsackievirem B3 (CV-B3)10 . V Brazílii nebyla podána žádná zpráva o souvislosti s EV-4 a HFMD, možná kvůli nedostatku klinických podezření.

EV-4 je obecně spojován s aseptickou meningitidou, encefalitidou, paralýzou, Güillan-Barré syndromem, exantémem a respiračními onemocněními a byl zjištěn po celém světě, především jako příčina propuknutí aseptické meningitidy: v letech 1972-1999 na Kubě, v letech 1981-1989 v Kapském Městě v Jihoafrické republice, v dubnu 1997 v oblastech Izraele a Palestinské samosprávy, v letech 1988-2003 ve Španělsku, na podzim 1982 v Polsku a v roce 2002 ve Vellore a okolí v Indii8,9,11,14,15,18.

Typicky jsou enterovirové infekce buď asymptomatické, nebo mají za následek mírné onemocnění. Proto se doporučuje odebrat vzorky séra k provedení titrace protilátek mikroneutralizační technikou, což by byl další parametr k potvrzení, že izolovaný virus je zodpovědný za onemocnění. V souvislosti s izolací stolice potvrzuje čtyřnásobné zvýšení titrace séra (sérokonverze) akutní infekci. V této studii bohužel nebylo možné získat vzorky séra.

Přesto bylo všech dalších osm dětí diagnostikováno jako HFMD lékařskými centry na základě klinických příznaků.

Ačkoli tento výsledek nemohl stačit k tvrzení, že EV-4 byl příčinou onemocnění, zdálo se být rozumné uzavřít, že signály a zjevné klinické projevy potvrzují hypotézu, že virus není přechodným virem.

Je důležité zdůraznit, že CV-A16 a HEV-71, známé jako hlavní příčina HFMD, obvykle produkují CPE v buněčných kulturách RD, HEp2 a Vero; v této studii však nebyly identifikovány.

Naše práce ukazuje EV-4 jako původce HFMD a naznačuje možnost, že další sérotypy HEV, by mohly případně souviset s případy HFMD. Tato kazuistika zdůrazňuje nutnost zintenzivnit epidemiologické a laboratorní studie tohoto sérotypu a v Brazílii je třeba zvýšit dohled nad dalšími sérotypy HEV, které se podílejí na vzniku HFMD.

PODĚKOVÁNÍ

Zvlášť děkujeme Dr. Luísu Florênciu Salles Gomesovi za jeho návrhy a kritické připomínky k této práci.

1. ABUBAKAR, S.; CHEE, H.Y.; SHAFEE, N.; CHUA, K.B. & LAM, S.K. – Molecular detection of Enteroviruses from an outbreak of hand, foot and mouth disease in Malaysia in 1997. Scand. J. infect. Dis., 31: 331-335, 1999.

2. ALSOP, J.; FLEWETT, T.H. & FOSTER, J.R. – „Hand-foot-and-mouth disease“ in Birmingham in 1959. Brit. med. J., 5214: 1708-1711, 1960.

3. BASTIS, D.; SIMONET, S.; PATTERSON, M.A. & NEILL, S. – Identifications of Enteroviruses by indirect immunofluorescence using monoclonal antibodies. Clin. diagn. Virol., 3: 38-93, 1995.

4. CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION – Respiratory and Enteric Viruses Branch, 2004. (dostupné v http://www.cdc.gov/ncidod/dvrd/revb/Enterovirus/hfhf.htm). Dostupné v květnu 2005.

5. CHUA, B.H.; McMINN, P.C.; LAM, S.K. & CHUA, K.B. – Comparison of the complete nucleotide sequences of echovirus 7 strain UMMC and the prototype (Wallace) strain demonstrates significant genetic drift over time. J. gen. Virol., 82: 2629-2639, 2001.

6. GRAHAM, B. – Nemoc rukou, nohou a úst. Časopis EMedicine, 2002. (dostupné v http://www.emedicine.com/derm/topic175htm). Dostupné v květnu 2005.

7. GRANDIEN, M.; FORSGREN, M. & EHRNST, A. – Enteroviry a reoviry. in: LENNETTE, E.H. & SCHMIDT, N.J., vyd. Diagnostické postupy u virových a rickettsiových onemocnění. 6. ed. Washington, American Public Health Association, 1989. s. 513-578.

8. HANDSHER, R.; SHULMAN, L.M.; ABRAMOVITZ, B. et al. – A new variant of echovirus 4 associated with a large outbreak of aseptic meningitis. J. clin. Virol., 13: 29-36, 1999.

9. McINTYRE J.P. & KEEN, G.A. – Laboratory surveillance of viral meningitis by examination of cerebrospinal fluid in Cape Town 1981-9 (Laboratorní sledování virové meningitidy vyšetřením mozkomíšního moku v Kapském Městě 1981-9). Epidem. Infect., 111: 357-371,1993.

10. MOREIRA, R.C.; CASTRIGNANO, S.B.; CARMONA, R.C. et al. – An exanthematic disease epidemic associated with coxsackievirus B3 infection in a day care center. Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo, 37: 235-238, 1995.

11. PIERZCHALA, K.; GRUDZINSKA, B.; BARA, M. & KLOSINSKA, E. – Pozdní následky epidemické virové meningitidy. Wiad. lek., 42: 55-158, 1989.

12. ROBINSON, C.R.; DOANE, F.W. & RHODES, A.J. – Report of an outbreak of febrile illness with pharyngeal lesions and exanthem: Toronto, léto 1957; izolace viru Coxsackie skupiny A. Canad. med. Ass. J., 79: 615-621, 1958.

13. ROTBART, H.A. – Enzymatická amplifikace RNA enterovirů. J. clin. Microbiol., 28: 438-442,1990.

14. SARMIENTO, L.; MAS, P.; GOYENECHEA, A. et al. – First epidemic of echovirus 16 meningitis in Cuba. Emerg. infect. Dis., 7: 887-889, 2001.

15. SATHISH, N.; SCOTT, J.X.; SHAJI, R.V. et al. – An outbreak of echovirus meningitis in children. Indian Pediat., 41: 384-388, 2004.

16. SCOTT, L.A. & STONE, M.S. – Virové exantémy. Derm. Online J., 9: 4, 2003.

17. SHIMIZU, H.; UTAMA, A.; YOSHII, K. et al. – Enterovirus 71 z fatálních a nefatálních případů epidemií nemoci rukou, nohou a úst v Malajsii, Japonsku a na Tchaj-wanu v letech 1997-1998. Jap. J. infect. Dis., 52: 12-15, 1999.

18. TRALLERO, G. & AVELLÓN, A. – Importancia del diagnostico de los Echovirus desde el punto de vista epidemiológico. Circulación de Echovirus 11 en los últimos años en España – Control Calidad SEIMC, 2004. (dostupné v http://seimc.org/control/revi_viro/echo11.htm). Dostupné v květnu 2005

.