Degradace spojená s endoplazmatickým retikulem (ERAD)

2.1 Proces skládání proteinů a rozpoznávání nesprávně složených proteinů

Přibližně 30 % všech proteinů a všechny transmembránové proteiny buňky jsou syntetizovány v ER, které funguje jako portál pro vstup do sekreční cesty prostřednictvím kanálu Sec61 . Při translokaci je N terminální hydrofobní signální sekvence nově syntetizovaného proteinu štěpena peptidázovým komplexem . V ER probíhají ko- a posttranslační modifikace, jako je tvorba disulfidových vazeb, počáteční kroky N-glykosylace a ukotvení glykofosfatidylinositolu (GPI).

Oxidační prostředí ER napomáhá tvorbě disulfidových vazeb, které stabilizují terciární strukturu proteinu a usnadňují jeho sestavení. Během procesu skládání vznikají disulfidové vazby oxidací párů volných thiolů na cysteinových zbytcích pomocí protein disulfid izomeráz (PDI). PDI fungují jako cykly a po počáteční oxidaci jsou disulfidové vazby někdy izomerizovány PDI a ERp57, což je thioloxidoreduktáza, za účelem stabilizace správného skládání proteinu . Naopak redukce disulfidových vazeb chybně složených proteinů je nezbytná pro retrotranslokační krok ERAD. PDI skutečně umožňuje retrotranslokaci simian virüs-40 (SV-40) a cholera toxinu . ERdj5, ER oxidoreduktáza, redukuje disulfidové vazby a interaguje s EDEM (ER-degradaci posilující mannosidase-like protein) a rovněž urychluje krok retrotranslokace SV-40 . ERDJ5 také reguluje degradaci chorobné varianty α1-antitrypsinu (null Hong Kong) .

Skládání napomáhají molekulární chaperony, které chrání před chybným skládáním a rozkládáním. Glykany podobné chaperonům se vážou na N-glykany a hrají klíčovou roli při skládání a odbourávání proteinů. Je zřejmé, že N-glykosylace, kontrola kvality skládání proteinů a ERAD jsou funkčně propojeny. Po vstupu do ER je velká většina nově syntetizovaného polypeptidového řetězce glykosylována N-vazbou. Enzym oligosacharyltransferáza rozpoznává konsenzuální sekvenci Asn-X-Ser/Thr ve většině molekuly vznikajícího proteinu a kovalentně integruje jádrové glykanové skupiny s vysokým obsahem manózy (Glc3Man9GlcNAc2) z dolicholu lokalizovaného na membráně ER do proteinu . Vzhledem k velmi krátkému poločasu triglykosylované formy oligosacharidu vázaného na protein začíná zpracování glykanu ihned po přenosu prekurzorových glykanových skupin prostřednictvím enzymů glukosidáz. Po odštěpení dvou ze tří glukosových zbytků může vznikající protein interagovat s lektiny kontroly kvality, jako jsou CNX a CLR. Tato interakce je zachována až do odštěpení zbývajícího glukózového zbytku. Po uvolnění glykoproteinu z cyklu CNX/CLR se odřízne i poslední glukóza a vznikne neglykosylovaný substrát. Tím se naruší interakce substrátu s lektinovými chaperony. Pokud je v této fázi protein správně složen, může opustit ER a dostat se na místo určení. Pokud je však glykoprotein stále nesložený, je zadržen v ER a reglukosylován UDP-glukosa:glykoprotein glukosyltransferázou a odražen pomocí CNX a CLR, což dává proteinu více času na správné složení . Mechanismy, které se podílejí na ukončení cyklů reglykosylace/deglykosylace, nejsou dosud známy. Je však zřejmé, že pokud polypeptidový řetězec nemůže po opakovaných pokusech o skládání dosáhnout zralé formy, jsou terminální manózové zbytky z jádra glykanového řetězce postupně odstraňovány ER α1,2-mannosidázou I (ERMan1). ERMan1 vytváří izomer Man8GlcNAc2 odstraněním manózového zbytku ze střední větve N-glykanů. Tímto ořezáním se glykoprotein stává horším substrátem pro reglykosylaci a výstup z cyklu CNX .

Hydrofobní skvrny správně složených proteinů jsou obvykle pohřbeny uvnitř rozpustných proteinů. U nesprávně složených proteinů však mohou být tyto skvrny obnaženy. Pokud má protein obnažené hydrofobní plochy, BiP se na ně váže, aby tyto plochy náchylné k agregaci skryl pro pokusy o správné skládání tím, že zabrání agregaci. Pokud se však skládání nepodaří nebo se zpozdí, slouží rozšířená interakce mezi chaperonem a chybně složeným proteinem k sofistikovanému procesu, kdy je protein přenesen na jiné chaperony a/nebo do procesu ERAD .

Je všeobecně známo, že prvním krokem ERAD je selekce chybně složených proteinů chaperony. Již v roce 1999 bylo zjištěno, že substráty ERAD u kvasinek se nápadně liší v požadavku na ER-luminální Hsp70, BiP . Degradace rozpustných substrátů, jako je pαF a mutantní forma vakuolární proteázy karboxypeptidázy Y* (CPY*), byla závislá na BiP, zatímco degradace transmembránových proteinů Pdr5*p, Ste6-166p, Sec61-2p a Hmg2p probíhala nezávisle na BiP. V roce 2004 se ukázalo, že substráty s cytosolickou doménou, jako je Ste6-166p, byly degradovány nezávisle na BiP, zatímco proteiny s luminálními defekty vyžadovaly BiP, což naznačuje, že v závislosti na topologii chybně složené léze (lumen ER, membrána ER a cytoplazma) fungují při rozpoznávání a cílení k degradaci cytosolické nebo luminální chaperony .

Je možné studovat rozpoznávání substrátu během ERAD pomocí modelových chybně složených proteinů. Je zřejmé, že pro degradaci chybně složených glykoproteinů je nutná de-mannosylace, protože inhibice tohoto ořezávání manózy stabilizuje chybně složené glykoproteiny v ER . Nadměrná exprese ERMan1 urychluje degradaci N-glykosylovaných proteinů . Výsledný glykoprotein obsahující Man8-GlcNAc2 se po tomto trimování stává substrátem pro EDEM1 (ER-degradation enhancing mannosidase-like protein 1, Htm1p u kvasinek) – lektin příbuzný mannosidáze v ER. Dále bylo navrženo, že chybně složené glykoproteiny interagují s ERManI a EDEM1 za účelem jejich ERAD a interakce lektin-sacharid se ukázala jako klíčová pro rozpoznání substrátu EDEM . Ačkoli se předpokládalo, že ERMan1 je biologickým časovačem zahajujícím ERAD chybně složených proteinů , nedávné studie odhalily, že mannosidasy nejsou výhradně zodpovědné za intenzivní demannosylaci během ERAD, zejména za jiných než základních podmínek. Za podmínek stresu ER (unfolded protein response active) zvyšuje transkripční zvýšení EDEM1 účinnost ERAD potlačením proteolytické downregulace ERMan1 . Ukázalo se, že EDEM hrají důležitou roli také při demannosylaci substrátů . EDEM1 také zabraňuje reglykosylaci a podporuje retrotranslokaci a degradaci některých substrátů ERAD . Na druhou stranu, zatímco mannosidázová homologická doména (MHD) Htm1p je nezbytná pro vazbu substrátu, savčí EDEM1 váže chybně složené proteiny nezávisle na MHD doméně, a proto vazba EDEM1 na substrát nemusí vyžadovat ořezávání manózy nebo dokonce glykosylaci . Kromě N-vázaných oligosacharidových částí glykoproteinů tedy může EDEM1 rozpoznávat i skládací léze chybně složených proteinů. Souhrnně lze říci, že EDEM se přímo nebo nepřímo podílejí na demannosylaci glykoproteinů a/nebo slouží jako receptory, které vážou a zaměřují manózou ořezané proteiny pro ERAD (obr. 1).

Trunkce terminální manózy z větve C vystavuje α terminální zbytky manózy s vazbou α1,6 fungující jako rozpoznávací signál pro lektiny ERAD, jako je OS9 (Yos9 u kvasinek) a XTP3-B (obr. 2). Prostřednictvím své domény homologie mannosa-6-fosfátového receptoru (MRH) oba proteiny rozpoznávají především α1,6-vázanou mannosu j. OS-9 navíc rozpoznává také α1,6-vázanou mannosu e a c .

Několik zpráv naznačuje, že faktory (EDEM, OS9 a XTP3-B) potřebné pro rozpoznávání a cílení substrátu se nacházejí v supramolekulárních komplexech a/nebo interagují s důležitými regulátory ERAD . Například EDEM1 interaguje s CNX, přijímá substráty z cyklu CNX a usnadňuje degradaci substrátů ERAD, jako je mutant NHK-α1-antitrypsin . EDEM1 se také spojuje se složkami retrotranslokačního mechanismu ER. Předpokládá se, že EDEM1 váže chybně složené proteiny a pomocí své MHD domény zaměřuje aberantní proteiny na ER-rezidentní glykoprotein SEL1L proteinu ubikvitin ligázového komplexu Hrd1-SEL1L . SEL1L tvoří lešení pro několik faktorů rozpoznávajících luminální substráty a spojuje je s Hrd1. OS9 a XTP3-B se také spojují s komplexem Hrd1-SEL1L, který zahrnuje také BiP a GRP94 . Dále se navrhuje, aby XTP3-B spojoval BiP s komplexem Hrd1 . Podle hypotézy tyto tři chaperony (EDEM1, OS9 a XTP3-B) fungují jako oligomery, kde jeden monomer interaguje se substrátem a druhý s komplexem Hrd1-SEL1L . Kromě toho EDEM1 také interaguje s Derlinem, transmembránovým proteinem, který je kandidátem na translokátor ; dále se ukázalo, že Derlin2 posiluje interakci EDEM1 s cytosolickou AAA-ATPázou p97, která spojuje hydrolýzu ATP s retrotranslokací chybně složených proteinů .

Je zřejmé, že krok rozpoznání substrátu v ERAD je komplikovaný mechanismus, na němž se podílí několik různých enzymů a chaperonů, které mají v ERAD odlišné, ale sladěné role. V závislosti na substrátech se navíc počet a vlastnosti zapojených proteinů liší. Například byla navržena sladěná úloha EDEM, ERdj5 a BiP při degradaci chybně složených proteinů . Po výstupu z cyklu CNX-CLR EDEM1 dále zkracuje strukturu glykanu Man8-GlcNAc2 a ERdj5 redukuje disulfátové vazby. Současně ERdj5 aktivuje ATPázovou aktivitu BiP. BiP navázaný na ADP se váže na chybně složený protein a udržuje ho ve formě retrotranslokační složky, dokud se nepřenese do retrotranslokačního komplexu .

ERAD se také podílí na kontrole kvality neglykosylovaných proteinů, která je nezávislá na proteinech podobných lektinům. Lehký řetězec imunoglobulinu (Ig-K-LC), neglykosylovaný substrát ERAD, je degradován způsobem závislým na BiP. Okuda-Shimizu a Hendershot charakterizovali dráhu ERAD pro tento neglykosylovaný substrát BiP a různé dynamiky proteinových interakcí, které v tomto procesu zřejmě hrají roli. Ig-K-LC má dvě intramolekulární disulfidové vazby a jeho plně oxidovaná forma nemá schopnost přecházet z ER do cytoplazmy. BiP interaguje pouze s částečně oxidovanou formou Ig, čímž zabraňuje úplné oxidaci Ig-K-LC, a tím usnadňuje jeho uvolňování z ER . Kromě toho byl transmembránový protein obsahující doménu UBL, homoCys-responsive ER-resident protein (HERP), označen za receptor pro neglykosylované substráty BiP . HERP interaguje s Derlin1 a částečně oxidovaný Ig-K-LC je přenesen z BiP do komplexu HERP-Derlin1-Hrd1 a následně směrován k proteasomální degradaci . Kromě BiP se ukazuje, že pro ERAD neglykosylovaných proteinů je důležitá také ERdj5 jako disulfidreduktáza . Neglykosylované substráty zachycené BiP jsou předány ERdj5 ke štěpení disulfidových vazeb. Poté jsou tyto substráty pomocí BiP přeneseny do SEL1L k retrotranslokaci . Kromě BiP se na ERAD neglykosylovaných proteinů podílejí OS9 i XTP3-B .

.