Defosforylace

V.B Proteinové fosfatázy v signalizaci RPTK

Defosforylace tyrozinu je dalším rychle působícím mechanismem inhibice nebo ukončení signalizace RPTK. Fosforylace proteinů při transdukci signálu je reverzibilní a PTK působí společně s PTPázami při určování zahájení, rozsahu a ukončení tyrozinové fosforylace. Ke snížení regulace signalizace RPTK dochází nejen přímou defosforylací fosfotyrosinu samotné RPTK (tj. RPTK je substrátem pro PTPázu), ale také defosforylací klíčového downstream cíle RPTK. Protože tyrosinem fosforylované proteiny, serinem a threoninem fosforylované proteiny a dokonce i fosfolipidy jsou mediátory signalizace RPTK, existují příklady proteinových serin/treonin specifických fosfatáz a fosfoinositid specifických lipidových fosfatáz, které rovněž zprostředkovávají downregulaci signalizace iniciované RPTK. Následuje několik příkladů a stručný obecný popis proteinových fosfatáz.

Všechny identifikované PTPázy obsahují konzervovanou, ∼280 aminokyselin dlouhou PTPázovou doménu. Jejich specifická katalytická aktivita je přibližně 1000krát vyšší a mnohem méně specifická než u PTK. Stejně jako v případě PTK lze PTPázy rozdělit na transmembránové a cytoplazmatické PTPázy. Transmembránové PTPázy obsahují extracelulární oblasti s motivy, jako jsou repetice podobné fibronektinu typu III, repetice podobné kadherinu a domény podobné imunoglobulinu. Mají jednu transmembránovou oblast, za kterou obvykle následují dvě PTPázové domény, z nichž pouze jedna zřejmě přispívá ke katalytické aktivitě. Jak by naznačovala jejich extracelulární oblast, některé transmembránové PTPázy, například PTPκ a PTPμ, se podílejí na homofilní adhezi mezi buňkami a PTPμ může stabilizovat kontakty mezi buňkami defosforylací kateninů a kadherinů. Tyto a další transmembránové PTPázy se nepodílejí na přímé defosforylaci RPTK, na rozdíl od cytoplazmatických PTPáz, z nichž některé jsou schopny přímo defosforylovat RPTK.

Cytoplazmatická protein tyrozin fosfatáza SHP-1 je jednou z pouhých dvou identifikovaných PTPáz obsahujících SH2 doménu. SHP-1 se váže na aktivované RPTK, jako je CSF-1 a Kit/SCF receptor, prostřednictvím jedné ze svých dvou SH2 domén. Vazba SH2 SHP-1 a strukturně příbuzné SHP-2 (viz dále) uvolňuje autoinhibiční omezení domény PTPázy. V souladu s tím bylo prokázáno, že receptory CSF-1 i Kit/SCF jsou přímými substráty pro SHP-1 a že SHP-1 je důležitý pro normální downregulaci signalizace Kit a CSF-1 receptorů. To má rovněž fyziologický význam. Proto mají myši s fenotypem motheaten (me), který je způsoben přirozeně se vyskytujícími ztrátovými mutacemi (LOF) v SHP-1, četné abnormality krvetvorby v důsledku hyperproliferace myeloidních/monocytárních a žírných buněk. Předpokládá se, že tyto defekty způsobuje deregulace signalizace CSF-1 a receptoru Kit, což podporují studie, které ukazují, že fenotyp dominantních white-spotting (W) mutantních myší, které mají přirozeně se vyskytující LOF mutace v Kit, se zmírňuje křížením s me mutantními myšmi a naopak. Tyto a novější údaje ukazující alternativní transkripty způsobující buď zkrácení SHP-1, nebo frameshift mutace vedoucí ke ztrátě SHP-1 v primárních nádorových buněčných liniích exprimujících Kit, které byly vytvořeny z leukemických pacientů, naznačují, že SHP-1 je nádorový supresor.

Proteinová tyrozinfosfatáza PTP1B je další cytosolová fosfatáza, která se podílí na přímé downregulaci signalizace RPTK. PTP1B se váže na aktivované receptory inzulínu a IGF-1 prostřednictvím své N-terminální katalytické domény neznámým mechanismem. Po navázání PTP1B přímo defosforyluje samotný inzulinový receptor a jeho hlavní přidružený dokovací protein, substrát inzulinového receptoru-1 (IRS-1). Cílená delece PTP1B u myší proto způsobuje hyperfosforylaci inzulinového receptoru a IRS-1 a senzitizaci inzulinové signalizace. PTP1B také defosforyluje STAT5a a STAT5b, čímž zabraňuje jejich jaderné translokaci a transkripční aktivitě. STAT5a a STAT5b jsou fosforylovány JAK aktivovanými cytokinovými receptory, ale jsou také fosforylovány přímo několika RPTK.

Na zesílení signalizace za RPTK se však podílí také PTP1B, stejně jako receptoru podobná PTPα a SHP-2, další fosfatáza obsahující SH2 doménu. PTP1B je nadměrně exprimována v buněčných liniích rakoviny prsu, kde způsobuje defosforylaci Tyr527 na C-konci c-Src. To vede ke zvýšené aktivitě kinázy Src, protože fosforylace tohoto místa je pro aktivitu Src inhibiční prostřednictvím alosterického, autoinhibičního mechanismu. Transmembránový RPTPα je in vivo fosforylován tyrosinem Tyr789, který vytváří vazebné místo pro c-Src, což umožňuje RPTPα defosforylovat Tyr527 v Src in vitro. Je zajímavé, že jak vazba, tak defosforylace Src jsou závislé na fosforylaci na Tyr789 a pro aktivaci Src pomocí RPTPα byl navržen mechanismus fosfotyrosinového vytěsnění. V souladu s tím kinázově defektní nebo Tyr789Phe mutanty RPTPα ruší neoplastickou transformaci nadměrně exprimovaným RPTPα a cílené narušení RPTPα způsobuje sníženou aktivitu členů rodiny Src v buňkách z mutantních myší, což koreluje se zvýšenou hladinou fosforylace Tyr527. SHP-2, který je všudypřítomně exprimován, se in vivo spojuje prostřednictvím svých SH2 domén s četnými RPTK a substráty PTK, včetně receptorů pro PDGF, EGF, inzulinu podobný růstový faktor-1 (IGF-1) a SCF, jakož i s dokovacím proteinem IRS-1. SHP-2 se v reakci na stimulaci několika růstovými faktory tyrosinfosforyluje a tyrosinfosforylovaný SHP-2 se váže na receptory pro PDGF nebo SCF a také na adaptorovou molekulu Grb2. Bylo prokázáno, že navázaný SHP-2 selektivně defosforyluje tyrosinové zbytky v PDGFR-β důležité pro vazbu PI 3′-kinázy a GAP pro Ras. Kromě toho mikroinjekce blokujících protilátek proti SHP-2 nebo exprese SH2 domén SHP-2 nebo katalyticky neaktivního SHP-2 inhibuje mitogenezi stimulovanou EGF, inzulinem a IGF-1. Tato zjištění naznačují, že SHP-2 je předřazeným aktivátorem signalizace Ras a dalších signálních drah regulovaných Grb2 a je pravděpodobně modulátorem signalizace PI 3′-kinázy indukované RPTK. Podobně jako u SHP-1 může vazba SHP-2 aktivovat jeho katalytickou funkci. Uvádí se také, že SHP-2 defosforyluje Tyr527 v C-konci Src, což zajišťuje další pozitivní regulaci signalizace.

Několik proteinových serin/treoninových kináz a jejich substrátů je defosforylováno hlavní serin/treonin specifickou fosfatázou PP2A. Jedná se o cytoplazmatickou a jadernou heterotrimerní fosfatázu, která se skládá ze strukturní podjednotky A. regulační podjednotky B a katalytické podjednotky C. PP2A je prostřednictvím své regulační podjednotky vázána na četné scaffold proteiny a její aktivita je přísně regulována v kontextu sestavených scaffoldů. Jedním z důležitých substrátů v signalizaci RPTK je cílová PI 3′-kináza Akt, proteinová serin/treoninová kináza zprostředkovávající přežití buněk částečně prostřednictvím fosforylace člena rodiny Bcl-2 Bad. PP2A defosforyluje aktivační fosforylační místo T308 v Akt, které je klíčové pro kinázovou aktivitu. Kromě toho může PP2A defosforylovat antiapoptotickou molekulu Bcl-2, čímž ruší její funkci přežití. Byla identifikována řada dalších substrátů pro PP2A, z nichž mnohé jsou důležitými následnými cíli RPTK.

Dvě fosfoinositid-specifické fosfatázy, PTEN, respektive SHIP1/2, specificky defosforylují polohu D-3 a D-5 inositolového kruhu v PtdIns(3,4,5)P3, jednom z hlavních efektorů signalizace PI 3′-kinázy. To působí proti signalizaci PI 3′-kinázy iniciované RPTK, a proto se ukázalo, že PTEN je často mutovaný lidský nádorový supresorový gen. Inaktivující mutace v PTEN hrají klíčovou roli u některých neuronálních nádorů, nádorů prsu a zárodečných buněk u lidí, což je spojeno se zvýšenou aktivitou Akt.

.