Chromatografie s gelovou filtrací

Použití chromatografie s gelovou filtrací

Chromatografii s gelovou filtrací, typ chromatografie s vyloučením velikosti, lze použít buď k frakcionaci molekul a komplexů ve vzorku na frakce s určitým rozsahem velikosti, nebo k odstranění všech molekul větších než určitá velikost ze vzorku, nebo ke kombinaci obou operací. Chromatografii s gelovou filtrací lze použít k separaci sloučenin, jako jsou malé molekuly, proteiny, proteinové komplexy, polysacharidy a nukleové kyseliny ve vodném roztoku. Pokud se jako mobilní fáze používá organické rozpouštědlo, označuje se tento proces jako gelová permeační chromatografie.

Chromatografii s gelovou filtrací lze také použít pro:

• Frakcionace molekul a komplexů v předem stanoveném rozmezí velikosti
• Analýza a stanovení velikosti
• Odstranění velkých proteinů a komplexů
• Výměna pufru
• Odstranění malých molekul, jako jsou nukleotidy, primery, barviva, a kontaminantů
• Ohodnocení čistoty vzorku
• Oddělení vázaných radioizotopů od nevázaných

Chromatografická média pro gelovou filtraci pro všechna výše uvedená použití jsou k dispozici v předbalených gravitačních kolonách, spinových kolonách, nízkotlakých a středotlakých chromatografických kolonách a pryskyřicích v lahvičkách.

Mechanismus gelové filtrační chromatografie

V koloně gelové filtrační chromatografie je stacionární fáze tvořena porézní matricí a mobilní fáze je pufr, který protéká mezi kuličkami matrice. Kuličky mají definovaný rozsah velikosti pórů, známý jako frakcionační rozsah. Molekuly a komplexy, které jsou příliš velké na to, aby se dostaly do pórů, zůstávají v mobilní fázi a pohybují se kolonou s proudem pufru. Menší molekuly a komplexy, které jsou schopny vstoupit do pórů, vstupují do stacionární fáze a pohybují se přes kolonu gelové filtrace delší cestou přes póry kuliček.

Každá molekula nebo komplex, který je nad frakcionačním rozsahem pro danou kolonu gelové filtrační chromatografie, se bude pohybovat kolonou rychleji než jakákoli molekula, která může vstoupit do stacionární fáze. Proto se jakákoli složka ve vzorku, která je nad frakcionačním rozsahem, bude eluovat jako první (v prázdném objemu) před čímkoli, co je ve frakcionačním rozmezí. Minimální velikost, která zůstane v mobilní fázi a nevstoupí do stacionární fáze, se nazývá vylučovací mez. Společnost Bio-Rad nabízí média a kolony pro gelovou filtrační chromatografii s vylučovacími limity v rozsahu tří řádů, od 100 daltonů do 100 000 daltonů (100 kDa).

Molekuly a komplexy, které mohou vstoupit do stacionární fáze, budou frakcionovány podle své velikosti. Menší molekuly budou migrovat hluboko do pórů a budou zpomaleny více než větší molekuly, které do pórů nevstoupí tak snadno, a proto jsou z kolony eluovány rychleji. Tento rozdíl v migraci póry vede k frakcionaci složek podle velikosti, přičemž největší se eluují jako první.

V kolonách gelové filtrační chromatografie určených pro odsolování, výměnu pufrů a odstraňování malých molekul, jako jsou nukleotidy, soli a malé sloučeniny snadno vstupují do pórů, jsou retardovány a migrují kolonou pomaleji než větší proteiny nebo nukleové kyseliny. Zajímavé složky ve vzorku jsou proto eluovány dříve než soli, nukleotidy atd. Soupravy pro čištění DNA využívající tento mechanismus často obsahují spinové kolony s gelovou filtrací.

Rozlišení, zde definované jako ostrost hranic mezi velikostními frakcemi, je určeno velikostí kuliček a řadou dalších faktorů. Menší velikost kuliček obecně poskytuje vyšší rozlišení v chromatografické koloně s gelovou filtrací. Kompaktní molekuly difundují stacionární fází rychleji než lineární molekuly. Velikostní exkluze, rozsah frakcionace a rychlost eluce jsou ovlivněny složením pufru, iontovou silou a pH. Pro frakcionaci složitých směsí proteinů může být nutné empiricky stanovit eluční časy a meze vylučování velikosti.

Média pro chromatografii gelovou filtrací

Důležitým kritériem pro média pro chromatografii gelovou filtrací je, aby média byla inertní a aby se na ně nevázalo nic ze vzorku ani z pufru. Dalším hlediskem je typ použité gelové filtrační kolony a to, zda se používá v tlakovém chromatografickém systému nebo v gravitačním průtoku či na spinových kolonách. Pokud se používá tlakový chromatografický systém, musí být kolona i médium schopné snášet použitý tlak a průtok.

Běžně používaná média pro gelovou filtrační chromatografii jsou založena na agarosových nebo polyakrylamidových kuličkách, dextróze pro gravitační nebo nízkotlaké systémy a polymerních pryskyřicích pro středotlaké systémy. Výběr média závisí na vlastnostech separovaných složek a dalších experimentálních faktorech. Níže jsou uvedeny obecné úvahy při určování výběru média pro gelovou filtrační chromatografii:

• Rozsah frakcionace
• Vylučovací mez velikosti
• Pracovní tlak
• Průtoková rychlost
• Viskozita vzorku
• Rozsah pH
• Autoklávovatelnost
• Tolerance pro organická rozpouštědla mísitelná s vodou; některé vzorky mohou být lépe rozpustné ve směsi vody a organických látek
• Tolerance pro detergenty, chaotropní látky, formamid atd.
• Pracovní teplota

Typy vzorků, výběr médií a nastavení chromatografického systému určí, které parametry jsou pro danou purifikační aplikaci nejdůležitější.