Chemická derivatizace v bioanalýze

Aplikace

Chemická derivatizace se již dlouho osvědčuje jako analytická technika v bioanalýze k překonání problémů spojených s nízkou ionizační účinností, nestabilitou sloučenin, špatnou selektivitou nebo nepřijatelným chromatografickým výkonem (špatná retence, špatný tvar píku a problémy s přenosem) a dokonce i špatnou těkavostí pro GC separaci . Tato technika je mocným nástrojem v mnoha oblastech chemie, včetně lékařství, forenzní chemie, potravinářství, dopingové kontroly a environmentálních disciplín. Cílem chemické derivatizace je změnit strukturu analytu (buď nukleofilu, nebo elektrofilu) pomocí chemického činidla (buď elektrofilu, nebo nukleofilu v závislosti na povaze analytu) a v důsledku toho vznikne nová sloučenina (derivát reakce) s lepšími chemickými a fyzikálními vlastnostmi pro analýzu. Reakční podmínky (množství činidla, reakční doba a teplota atd.) jsou optimalizovány ve prospěch vzniku požadovaného derivátu s co nejvyšším reakčním výtěžkem. Mohou být vyvinuty další postupy čištění vzorku, aby se odstranily nežádoucí vedlejší produkty a přebytečná činidla, čímž se minimalizují závěry o analytu při analýze.

Pomocí chemické derivatizace se stává možná i nemožná analýza. V literatuře bylo uvedeno mnoho příkladů; ovlivňují detekci GC, LC-MS/MS a NMR. Nejpozoruhodnější byla chromatografická separace enantiomerů pomocí chirální derivatizace s použitím specifických rozlišovacích činidel bez použití specializovaných chirálních kolon a separačních podmínek .

Uvažování

Pro úspěšnou derivatizaci je zásadní výběr vhodného chemického činidla, který závisí na konkrétní aplikaci. Obecně platí, že pokud je cílový analyt nukleofil (sloučenina s přebytkem elektronů), volí se jako činidlo elektrofil (sloučenina s celkovým nedostatkem elektronů) a naopak. Činidla musí být selektivní (zaměřená na jedno konkrétní místo molekuly), čímž se zabrání derivatizaci na více místech v cílové molekule, metabolitech nebo endogenních složkách. Jako příklad lze uvést, že u molekuly obsahující hydroxylové i aminoskupiny je třeba se vyhnout použití chloridů kyselin nebo anhydridů jako derivatizačních činidel, protože derivatizují obě funkční skupiny. Naopak použití dansylchloridu jako derivitizačního činidla je vhodné pro amino a fenolové funkční skupiny, protože nereaguje s alifatickými alkoholy. Mezi další náležitosti, které je třeba vzít v úvahu při výběru činidla, patří dostupnost (na trhu), čistota a cena. Obvykle jsou náklady na činidla minimální, a proto nepředstavují překážku pro použití.

Při použití optimalizovaných podmínek jsou postupy chemické derivatizace obvykle dostatečně robustní, aby mohly být použity pro farmaceutickou bioanalýzu, a jsou schopny splnit regulační očekávání. To se obvykle prokáže během přísného validačního procesu, při němž se hodnotí několik parametrů, mimo jiné přesnost, preciznost, selektivita, vliv matrice atd. Výběr vnitřního standardu je nezbytný pro korekci případných ztrát analytu během různých kroků manipulace se vzorkem a bioanalýzy; tím se zajistí robustnost analýzy. Pokud je to možné, měl by se použít deuteriový nebo 13C stabilní vnitřní standard, jinak lze nahradit analogem s podobnou reaktivitou, výtěžností a chromatografickými vlastnostmi. Rovněž je nezbytné vzít v úvahu a vyhodnotit, pokud je to možné, metabolické cesty analytu, který je předmětem zájmu; během derivatizačního postupu je třeba zabránit přeměně metabolitů zpět na mateřskou molekulu, protože tyto procesy často zahrnují náročné podmínky (pH, teplo, dlouhé inkubační doby atd.). Bohužel to může být komplikováno nedostatkem referenčních standardů pro metabolity a nedostatkem metabolických informací v rané fázi životního cyklu vývoje léčiva v důsledku diferencovaných nebo urychlených vývojových strategií.

Chemická derivatizace jako umělecká forma

Používání chemické derivatizace v posledních letech pokleslo, protože se vyvinuly nové separační technologie a staly se běžnějšími. Například vývoj superkritické fluidní chromatografie (SFC) otevřel novou cestu pro chirální stereoizomerní analýzu; tím se v některých případech snížila potřeba chirální derivatizace . Citlivější generace hmotnostně spektrometrických přístrojů s trojitým kvadrupólem a novými nebo zdokonalenými ionizačními technologiemi posouvají detekční limity na nízké pikogramové úrovně, v důsledku čehož se snížila poptávka po chemické derivatizaci za účelem zvýšení citlivosti analýzy (prostřednictvím lepší ionizace nebo selektivity). K poklesu chemické derivatizace v bioanalytických laboratořích přispěly také další technologie, včetně UHPLC; mikro-/nano-LC (pro lepší účinnost ionizace); přístroje TOF s možností iontové mobility (spíše elektronická separace než chemická/fyzikální). Přesto se tato technika stále používá pro velmi složité separace, kde výše uvedené technologie nemohou mít odpovídající dopad. Někdy má spojení chemické derivatizace s jednou z těchto technologií zvýšený/dodatečný dopad. Zejména kombinace SFC s chirální derivatizací se ukázala být lepší pro chirální separaci ve srovnání s touto SFC analýzou (údaje nejsou uvedeny).

Vzhledem k tomuto úpadku techniky a její složitosti ve srovnání s jinými analytickými technikami se chemická derivatizace vyvinula ve speciální „uměleckou formu“ v laboratoři, která vyžaduje specializované dovednosti v kombinaci se silnou znalostí chemie. V důsledku toho se méně vědcům v prostředí DMPK daří tuto techniku zvládnout a stát se odborníky v jejím používání. Otázkou tedy je, jak tyto dovednosti zachovat a předat je budoucím generacím analytických vědců. Speciální čísla, jako je toto, přehledové články, kapitoly v knihách, návody obsahující experimentální protokoly snad usnadní a podpoří používání chemické derivatizace jako skvělého analytického nástroje.

Outline

Toto tematické číslo zahrnuje pokroky ve stávajících derivatizačních technikách používaných v bioanalytickém výzkumu, stejně jako inovativní nové metody a přístupy (např, kombinace derivatizace s mikroproudovou LC-MS a myšlenka nových technik chemického značení od Niwa et al. ).

Cílem čísla je pokrýt aspekty týkající se:

• Derivatizační metody v bioanalýze LC-MS (včetně HPLC);

• Peptidová derivatizace pro analýzu proteinových terapeutik;

• Chirální derivatizační činidla aplikovaná na biologické vzorky (viz Vashistha et al. );

• Derivatizace pro analýzu endogenních sloučenin (viz „Beyond Classical Derivatization: Derivatizace steroidů v biologických vzorcích pro analýzy GC-MS a LC-MS“ od Marcose a kol. );

• Derivatizační postupy při dopingové kontrole lidí (viz zajímavý přehled od Athanasiadou a kol. ).

Přestože je pravda, že chemická derivatizace je jen dalším nástrojem v bioanalytické sadě nástrojů, je to „must have“ pro laboratoř DMPK, který bude mít i nadále vliv na řešení mnoha bioanalytických problémů.

Pokud se vám tedy váš analyt nelíbí, změňte ho (tedy pomocí chemické derivatizace)!“

.