Camptothecin

3.1 Úvod

Camptothecin (CPT) je monoterpenový indolový alkaloid, který byl poprvé izolován z Camptotheca acuminata Monroem Wallem a Mansukhem Wanim na oddělení USDA pro introdukci rostlin v polovině roku 1958 (Wall et al., 1966). C. acuminata je strom pocházející z Číny a jeho kůra se od nepaměti používá v čínské tradiční medicíně. Události spojené s objevem CPT přehledně popsali Wall a Wani (1996), spoluobjevitelé CPT a taxolu. Později v průběhu padesátých až pozdních šedesátých let minulého století podnítily silné protinádorové účinky CPT vědce ke zkoumání celkové chemické syntézy a ověření jeho potenciálu preklinickými a klinickými studiemi (Schultz, 1973). Účinnost CPT byla zkoumána ve Spojených státech provedením klinických studií fáze I (Gottlieb a Luce, 1972; Muggia et al., 1972) a fáze II (Moertel et al., 1972). Klinické použití CPT bylo zřejmé v Číně při léčbě rakoviny žaludku a močového měchýře a některých typů leukémie, často v kombinaci s kortikosteroidy (Pettit, 1976). První studie naznačily, že ve vodě rozpustná karboxylátová forma CPT (sodná sůl CPT) vykazovala v Číně určité pozitivní výsledky proti rakovině krku nebo močového měchýře (Xu, 1980). Výsledky klinických studií ze Spojených států s použitím karboxylátové formy CPT se však ukázaly jako ne tak slibné protinádorové léčivo. Tento rozpor by mohl být způsoben tím, že klinické studie v USA zahrnovaly pouze pacienty, kteří již vykazovali rezistenci na jinou léčbu. Nicméně nedostatečná konzistentní účinnost karboxylátové formy CPT v klinických studiích přiměla výzkumníky zaměřit se na laktonovou formu CPT pro další zdokonalení léčiv. Klinické zkoušky s CPT však byly v 70. letech v podstatě ukončeny kvůli neschopnosti vyřešit vlastnost CPT ve formě laktonu nerozpustného ve vodě, nízkému počtu odpovědí a vysoké toxicitě, jako je myelosuprese, gastrointestinální toxicita a hemoragická cystitida (Horwitz, 1975; Rozencweig et al., 1976)

Ačkoli klinické zkoušky CPT skončily v 70. letech, studie s ohledem na mechanismus jeho účinku pokračovaly i v pozdějších letech. Manželský tým doktorů Marshalla a Susan Horwitzových z Albert Einstein College of Medicine, stejně jako další, učinil první zjištění týkající se mechanismu účinku CPT. Jejich studie odhalily, že CPT inhibuje syntézu DNA a RNA (včetně ribozomální RNA) a vyvolává poškození DNA (Horwitz a kol., 1971; Kessel, 1971; Abelson a Penman, 1972; Wu a kol., 1971; Horwitz a Horwitz, 1973). Tito vědci pozorovali, že CPT je nejúčinnější během S-fáze buněčného cyklu, a předpokládali, že zásah během replikace DNA by mohl hrát roli v buněčné smrti vyvolané CPT. Pozdější studie ukázaly, že CPT zastavuje buněčný cyklus ve fázi S i G2, což jsou příčiny cytotoxicity CPT (Tsao et al., 1992; Goldwasser et al., 1996). Na počátku 80. let 20. století se klinicky zkoušela řada nepříbuzných látek poškozujících DNA k léčbě rakoviny a bakteriálních infekcí. Studie odhalily dvě různé třídy léčiv poškozujících DNA, jako jsou chinolonová antibiotika (cinoxacin, kyselina nalidixová a ciprofloxacin) a deriváty podofylotoxinu (etoposid a teniposid), u nichž bylo zjištěno, že poškozují DNA. Obě třídy léčiv měly stejný mechanismus účinku, tj. inhibici topoizomerázy II (Top2), enzymu aktivního během S-fáze, který napomáhá jevu replikace DNA (Froelich-Ammon a Osheroff, 1995). S ohledem na tuto skutečnost tým Dr. Leroye F. Liua z John Hopkins ve spolupráci s francouzskými laboratořemi Smith Kline & ve Filadelfii testoval, zda CPT má také podobnou aktivitu k vyvolání buněčné smrti. K jejich překvapení 125 µM CPT nedokázalo inhibovat štěpení DNA závislé na Top2. Když však testovali jiné enzymy spojené s replikací DNA, pozorovali silnou a na dávce závislou indukci poškození DNA v přítomnosti topoizomerázy I (Top1) (Hsiang et al., 1985). Ortologové Top1 se vyskytují u všech eukaryot a zdá se, že jsou nezbytným enzymem během vývoje u celé řady živočichů. Například vyřazení Top1 během raných stadií vývoje je letální jak pro Mus musculus (Morham et al., 1996), tak pro Drosophila melanogaster (Zhang et al., 2000a,b). DNA Top1 je enzym zodpovědný za uvolňování superzávitů DNA během procesu replikace a transkripce DNA. Konkrétně Top1 nejprve rozštěpí superzávitovou DNA, čímž do DNA zavede jednořetězcový zlom neboli nikl, a kovalentně se naváže na niklovaný 3′-konec DNA a umožní 5′-niklovanému vláknu kontrolovaně rotovat kolem intaktního vlákna. Po otočení Top1 nábožensky upraví nakrájené vlákno (Koster et al., 2005). Tato tvorba komplexu Top1-DNA během replikace DNA se běžně označuje jako „kovalentní komplex Top1“ díky kovalentní vazbě mezi Top1 a niklovaným vláknem (Pommier, 2006). CPT a jeho analogy vyžadují inhibici aktivity Top1 (Eng et al., 1988; Nitiss a Wang, 1988), což vede k buněčné smrti. V buňce se CPT integruje do kovalentního komplexu Top1/DNA a vytváří ternární komplex. Pro aktivitu je tedy nutný jak Top1, tak DNA, a CPT nevykazuje vazebnou schopnost v nepřítomnosti ani jednoho z nich (Leteurtre et al., 1993). CPT se váže jak na enzym Top1, tak na neporušené vlákno DNA prostřednictvím vodíkové vazby a brání jak religinaci nakrájené DNA, tak disociaci Top1 od DNA. Během replikace působí tento komplex CPT-ternary jako zátaras pro replikační vidličku. Kolize mezi ternárním komplexem a replikační vidličkou způsobuje smykové napětí na neporušeném vlákně DNA, což vede k jeho přerušení a buněčné smrti. Známým cílem CPT a jeho analogů je komplex Top1-DNA. Jak však bylo uvedeno výše, bylo prokázáno, že CPT ovlivňuje také syntézu proteinů, RNA a DNA, což naznačuje, že CPT může mít i další buněčné cíle. Inhibiční aktivita CPT je dále potvrzena, když se kvasinkové buňky s odstraněným Top1 stanou funkčně imunní vůči CPT a jeho analogům a savčí nebo lidské nádorové buňky se stanou rezistentní vůči CPT, když je Top1 mutován (Gongora et al., 2011; Urasaki et al., 2001; Benedetti et al., 1993; Chang et al., 2002; Arakawa et al., 2013; Jensen et al., 2016). Nadměrná exprese mutantního Top1 (Yanase et al., 1999) vede ke zvýšené aktivitě citlivosti Top1 na CPT (Wu et al., 2014). Nejrozsáhleji studovaným a zdokumentovaným způsobem účinku CPT a jeho analogů je inhibice DNA. V tomto přehledu jsou však diskutovány různé další buněčné a molekulární cíle CPT, které jsou rovněž zodpovědné za protinádorovou aktivitu

.