Alginát vápenatý a kuličky alginátu vápenatého a chitosanu obsahující celekoxib solubilizovaný v samoemulgující fázi
Abstrakt
V této práci byly vyvinuty kuličky alginátu vápenatého a alginátu chitosanu obsahující celekoxib solubilizovaný v samoemulgující fázi s cílem získat systém pro perorální podání léčiva, který je schopen oddálit uvolňování léčiva v kyselém prostředí a podpořit ho ve střevním kompartmentu. Důvody této práce souvisely se snahou zlepšit terapeutickou účinnost celekoxibu snížením jeho žaludečních nežádoucích účinků a zvýhodnit jeho použití v profylaxi rakoviny tlustého střeva a jako adjuvans při terapii familiární polypózy. Systémy byly připraveny ionotropní gelací za použití jehel o různých průměrech (400 a 600 μm). Byla zkoumána morfologie, velikost částic, chování při bobtnání a účinnost uvolňování léčiva in vitro u kuliček ve vodném prostředí s různým pH. Výsledky experimentů ukázaly, že přítomnost chitosanu ve formulaci způsobila zvýšení mechanické odolnosti struktury kuliček a v důsledku toho omezení schopnosti kuliček bobtnat a snížení rychlosti uvolňování léčiva při neutrálním pH. Alginát-chitosanové kuličky by mohly být dobrým nástrojem k zajištění podání celekoxibu do tlustého střeva.
1. Úvod
Systémy pro podávání léčiv obsahující biodegradabilní přírodní polymery jsou předmětem stále většího počtu výzkumných studií s ohledem na výhody, které tyto materiály mohou nabídnout . Mezi nimi jsou ve farmaceutické oblasti široce využívány ty, které obsahují alginát a chitosan .
Alginát je ve vodě rozpustný přírodní biopolymer získávaný z hnědých řas a složený ze střídajících se bloků 1-4 zbytků kyseliny α-L-guluronové a β-D-manuronové . Tento polymer tvoří hydrogely v přítomnosti dvojmocných kationtů jako Ca2+, Ba2+, Sr2+ a Zn2+ a tato vlastnost umožňuje přípravu kuliček s léčivem . Mechanismus tohoto procesu gelování zahrnuje guluronové zbytky se specifickou chelatací Ca2+ , které vytvářejí tzv. strukturu „egg-box“ . Mnoho výzkumníků zaměřilo svou pozornost na vývoj alginátových kuliček vápníku jako systémů řízeného podávání léčiv pro perorální podávání molekul léčiv a proteinů .
Chitosan je biokompatibilní, biologicky odbouratelný, netoxický, lineární polysacharid složený z D-glukosaminových a N-acetyl-D-glukosaminových jednotek spojených β-(1-4) glykosidickými vazbami . Chitosan lze získat částečnou deacetylací chitinu ze schránek korýšů a je široce používán pro buněčné kultury, podávání léčiv a potravinářské přísady .
Zesíťování alginátu a chitosanu v hydrogelu se používá k získání materiálů použitelných pro lékařské a farmaceutické aplikace; získané systémy se vyznačují zvýšenou stabilitou ve srovnání se systémy získanými s jedním polymerem . V oblasti řízeného podávání léčiv se v posledních letech věnuje velká pozornost polyelektrolytovému komplexu alginát-chitosan . Oba polymery tvoří polyelektrolytový komplex prostřednictvím iontové interakce mezi karboxylovými zbytky alginátu a amino zbytky chitosanu. Alginát-chitosanové kuličky lze vyrábět různými metodami: dvoustupňovým postupem a jednostupňovým postupem . V prvním případě se kuličky z alginátu vápenatého vyrábějí vpuštěním roztoku alginátu do želírovací lázně obsahující ionty vápníku. Vzniklé kuličky se poté přenesou do roztoku chitosanu, aby se na jejich povrchu vytvořila membrána. Jednostupňový postup vyžaduje, aby kapky roztoku alginátu spadly do vodného roztoku obsahujícího jak želírující látku pro alginát (např. vápenaté ionty), tak chitosan . Volba způsobu výroby je zodpovědná za vlastnosti kuliček kvůli množství navázaného chitosanu ve výsledném produktu. Současně jsou vlastnosti kuliček ovlivněny molekulovou hmotností vybraných polymerů a/nebo procentuálním zastoupením různých zbytků v molekulách polymerů .
Celekoxib, fluorovaný derivát benzensulfonamidu, je nesteroidní protizánětlivé léčivo (NSAID) s vysoce selektivním inhibičním účinkem na cyklooxygenázu-2 (COX-2). Má protizánětlivé, analgetické a antipyretické účinky v důsledku inhibice syntézy prostaglandinů katalyzované COX-2. V poslední době byla tato látka často zkoumána pro svou protinádorovou aktivitu pomocí modelů in vitro a in vivo . V preklinických studiích celekoxibu byla zaznamenána výrazná protinádorová aktivita proti dlaždicobuněčnému karcinomu hlavy a krku, karcinomu tlustého střeva, karcinomu prsu a karcinomu plic .
V této práci byly vyvinuty alginátové a alginát-chitosanové kuličky obsahující celekoxib rozpuštěný do samoemulgující fáze s cílem získat systém pro podávání léčiva pro perorální podání, který je schopen oddálit uvolňování léčiva v kyselém prostředí a podpořit ho ve střevním kompartmentu. Důvodem této práce byla snaha zlepšit terapeutickou účinnost celekoxibu snížením jeho žaludečních nežádoucích účinků a zvýhodnit jeho použití v profylaxi rakoviny tlustého střeva a jako adjuvans při terapii familiární polypózy . Cílem této studie bylo vyhodnocení a porovnání vlastností kuliček naložených v alginátu vápenatém a alginátu vápenatém-chitosanu s celekoxibem. Byla zkoumána morfologie, velikost částic, chování při bobtnání a účinnost uvolňování léčiva in vitro u kuliček ve vodném prostředí s různým pH.
2. Materiály a metody
2.1. Materiály a metody
2.1. Materiály a metody Materiály
Celekoxib byl získán od společnosti Chemos GmbH (Regenstauf, Německo). Bezvodý chlorid vápenatý a alginát sodný (molekulová hmotnost 120000-190000 g/mol; poměr mannuronových a geluronových zbytků 1,56) byly zakoupeny od společnosti Sigma Aldrich (Milán, Itálie), zatímco nízkomolekulární chitosan byl od společnosti Fluka (Milán, Itálie). Labrasol (kaprylokaproylmakrogol-8-glyceridy) byl darem firmy Gattefossè (Milán, Itálie); TPGS (D-α-tokoferyl polyethylenglykol 1000 sukcinát) laskavě věnovala firma Isochem (Gennevillers, Francie). Všechny ostatní chemikálie byly analytické kvality.
2.2. Příprava kuliček alginátu vápenatého
Kulečky alginátu vápenatého byly připraveny gelovací metodou s použitím vápenatých iontů jako síťovacího činidla. Podrobněji řečeno, 1,5% (w/w) vodný roztok alginátu sodného byl smíchán se samoemulgující fází s obsahem léčiva v poměru 4 : 1 a po kapkách přidán do 100 mM roztoku CaCl2 . Samoemulgující fáze byla připravena smícháním odvážených množství Labrasolu a TPGS při 50 °C a rozpuštěním celekoxibu v roztoku pomocné látky. Emulze (roztok alginátu sodného a samoemulgující fáze) byla ručně vytlačována v kalicí lázni jehlami o vnitřním průměru 400 nebo 600 μm za stálého mírného míchání při pokojové teplotě. Po 15 minutách byly kuličky sebrány, promyty deionizovanou vodou k odstranění přebytku vápenatých iontů a poté sušeny při 40 °C přes noc. Složení připravených přípravků s kódovým označením CAl 600 a CAl 400 bylo uvedeno v tabulce 1.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2.3. Vápenaté kuličky. Příprava kuliček alginátu vápenatého a chitosanu
Kulečky alginátu vápenatého a chitosanu (označené jako CAlCh 600 a CAlCh 400) byly připraveny jednokrokovou metodou. Postup byl totožný s postupem přijatým v případě alginátových kuliček s tou výjimkou, že vytvrzovací lázeň tvořil 0,2% (w/w) roztok chitosanu ve zředěné kyselině octové (1%) obsahující CaCl2 o koncentraci 100 mM. Složení chitosanových přípravků bylo uvedeno v tabulce 1.
2.4. Morfologická analýza a analýza velikosti částic
Morfologie mokrých a sušených kuliček a velikost částic sušených kuliček byly analyzovány pomocí stereomikroskopu Motic SMZ168 a softwaru pro analýzu obrazu (Motic Image Plus 2.0). Pro každý přípravek byla velikost částic vypočtena jako průměrná hodnota velikosti 20 vysušených částic.
2,5. U každého přípravku byla velikost částic vypočtena jako průměrná hodnota velikosti 20 vysušených částic. Obsah léčiva
Šest miligramů vysušených kuliček naložených léčivem bylo rozpouštěno v roztoku fosfátového pufru (100 ml) o pH 6,8 s přídavkem 0,75 % (w/v) laurylsulfátu sodného při 70 °C za míchání po dobu dvou hodin. Po ochlazení byly získané roztoky přefiltrovány a analyzovány spektrofotometricky při vlnové délce 255 nm; výsledky jsou průměrem nejméně tří stanovení.
2.6. Roztoky, které byly zfiltrovány a analyzovány při vlnové délce 255 nm. Studie bobtnání
Studie bobtnání byly provedeny při 37 °C na sušených kuličkách vložených do tří vodných médií vyznačujících se různým pH: kyselina chlorovodíková o pH 1,0 a fosfátový pufr o pH 6,8 a pH 7,4.
Přesně odvážená množství sušených kuliček alginátu vápenatého a alginátu vápenatého-chitosanu byla vložena do skleněných lahviček obsahujících 5 ml každé tekutiny. Po stanovených časových intervalech (5, 15, 30, 60 a 120 minut) byly vzorky odebrány, jemně otřeny papírem a znovu zváženy. Dynamická změna hmotnosti kuliček v závislosti na čase, definovaná jako stupeň bobtnání (Sw), byla vypočtena podle následující rovnice:kde je hmotnost kuliček v nabobtnalém stavu v daném čase a je počáteční hmotnost vysušených kuliček .
2.7. Studie uvolňování celekoxibu
Studie uvolňování in vitro byly provedeny v kyselině chlorovodíkové při pH 1,0 a ve fosfátovém pufru při pH 6,8 a při pH 7,4 s přídavkem 0,75 % laurylsulfátu sodného, aby bylo zaručeno zachování podmínek potopení. Studie byly prováděny umístěním přesně odváženého množství každého přípravku, odpovídajícího 8 mg celekoxibu, do 500 ml zvolené tekutiny při teplotě 37 °C a rychlosti otáčení 100 otáček za minutu (přístroj 2, pádlo). Filtrované vzorky byly odebírány v určitých časových intervalech bez výměny a analyzovány na obsah celekoxibu pomocí UV spektrofotometru při vlnové délce 255 nm v případě tekutiny HCl a fosfátového pufru o pH 6,8 nebo při vlnové délce 256 nm v případě fosfátového pufru o pH 7,4. Každý experiment byl proveden ve třech opakováních.
Účinnost uvolňování léčiva z kuliček alginátu vápenatého a alginátu vápenatého-chitosanu byla porovnána pomocí parametrů rozpouštění t10%, t50% a t90%, které udávají časové body, ve kterých se uvolnilo 10%, 50% a 90% léčiva, a parametru podobnosti f2 . Aby byly křivky považovány za podobné, měly by se hodnoty f2 blížit hodnotě 100 a hodnoty f2 vyšší než 50 (50-100) zajišťují stejnost nebo rovnocennost obou křivek.
2.8 . Statistická analýza
Výsledky byly statisticky analyzovány za účelem testování významných rozdílů pomocí Studentova t-testu při 95% intervalu spolehlivosti; za statisticky významné byly považovány hodnoty menší než 0,05.
3. Výsledky a diskuse
Alginátové a alginát-chitosanové kuličky byly získány metodou ionotropní gelace kapáním emulze složené z vodného roztoku alginátu a samoemulgující fáze s náplní léčiva přes jehly 23 G (600 μm) nebo 27 G (400 μm) v želírovací lázni chloridu vápenatého nebo chloridu vápenatého-chitosanu. Jako pomocné látky pro samoemulgující fázi byly vybrány Labrasol, tekutá složka se samoemulgujícími a rozpustnost zvyšujícími vlastnostmi, a D-α-tokoferyl polyethylenglykol 1000 sukcinát jako koemulgující a absorpci zvyšující látka (tabulka 1). Složení samoemulgující fáze bylo stejné jako v předchozí práci .
Stereomikroskopické snímky vlhkých a suchých alginátových a alginát-chitosanových kuliček jsou uvedeny na obrázcích 1 a 2. Bezprostředně po přípravě vykazují kuličky CAl 600 (obrázek 1 a) pravidelný tvar a homogenní rozměry; jsou bílé a neprůhledné s hladkým, lesklým a homogenním povrchem.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
.
(a)
(b)
(c)
(d)
Proces sušení nemění tvar kuliček, ale vede ke zmenšení jejich rozměrů a mění vlastnosti jejich povrchu, který je nepravidelný a zvrásněný (obrázek 1b). Úbytek vody vyvolává zmenšení vzdálenosti mezi polymerními řetězci a změnu struktury kuliček, která není kompaktní a souvislá, ale skládá se z malých mikrojader, která k sobě přiléhají. Plně nabobtnalé částice CAlCh 600 jsou mírně žluté, mají poměrně pravidelný tvar a hladký povrch (obrázek 1c)). V tomto případě proces sušení ovlivňuje kulovitý tvar kuliček (obrázek 1 d)); stávají se elipsoidními; jejich rozměr se zmenšuje a jejich povrch je velmi drsný. Po vysušení je navíc pozorována částečná aglomerace povrchu kuliček: lze ji přičíst adhezivním vlastnostem chitosanu. V případě kuliček připravených pomocí jehly o průměru 400 μm (obrázky 2 a)-2 c)) snímky pořízené bezprostředně po přípravě svědčí o tom, že u obou formulací (s chitosanem i bez něj) nejsou částice homogenní co do průměru, i když mají pravidelný tvar. Suché kuličky CAl 400 a CAlCh 400 (obrázek 2b) mají povrch charakterizovaný asperitou a konkávností; navíc v případě formulace alginát-chitosan je tvar částic zcela nepravidelný a je dobře patrná přítomnost pevných můstků chitosanu, které vážou kuličky a brání jejich oddělení.
Průměrná velikost kuliček naložených celekoxibem je mezi 715 a 896 μm (tabulka 2). Průměr kuliček byl významně ovlivněn průměrem jehly použité při přípravě (). Přídavek chitosanu k alginátovým kuličkám výrazně mění jejich rozměry pouze v případě, že byla použita jehla o průměru 400 μm (). Navíc, jak naznačují vysoké hodnoty směrodatné odchylky, při použití jehly 400 μm je konečný produkt rodinou částic nehomogenních rozměrů.
|
||||||||||||||||||||||||
Všechny přípravky obsahují vysoké množství léčiva (tabulka 2) homogenně rozložené v pomocné matrici a rozdíly mezi jejich obsahem léčiva nebyly významné s výjimkou CAlCh 400 mírně nižšího než u ostatních (). Procento celekoxibu v kuličkách převyšuje teoretickou hodnotu a je to způsobeno ztrátou Labrasolu během vytvrzování , což je oprávněné vzhledem k vysoké afinitě mezi touto pomocnou látkou a vodou, která ji vytlačuje z kuliček do želírovací lázně.
Specifickou vlastností alginátových nebo alginát-chitosanových mikročásticových systémů v suché formě je jejich schopnost po kontaktu s vodnou tekutinou rehydratovat, přijímat tekutinu a procházet procesem bobtnání, spojeným především s hydratací hydrofilních skupin polymerů. Pokud je tekutinou voda, proniká do částic, vyplňuje póry mezi polymerními řetězci a způsobuje významné bobtnání systému, aniž by docházelo k erozi/rozpadu. Výběrem kapalin s různým pH by se chování kuliček při bobtnání mohlo měnit. Z tohoto důvodu byla hodnocena schopnost bobtnání alginátu vápenatého a kuliček alginátu vápenatého a chitosanu v HCl o pH 1,0 a v roztocích fosfátového pufru o pH 6,8 a 7,4 (obr. 3-5).
V kyselém prostředí (obrázek 3) nejsou rozdíly v bobtnavosti čtyř přípravků; při tomto pH maximální stupeň bobtnání nepřesahuje 60 %. Alginátové a alginát-chitosanové kuličky absorbují část tekutiny; jejich hmotnost se zpočátku zvyšuje a poté zůstává konstantní. Při tomto pH dochází u alginátových systémů (CAl 600 a CAl 400) k protonizaci karboxylátových skupin polymeru lokalizovaných na povrchu částic a k vytvoření vrstvy kyseliny alginové. Nerozpustnost kyseliny alginové v této tekutině a tvorba vodíkových vazeb, které jsou zodpovědné za zvýšení stability struktury, brání pronikání další tekutiny do hlubších vrstev částic a omezují jejich bobtnání. Stejné chování při bobtnání je pozorováno u systémů CAlCh 600 a CAlCh 400. I když je v kyselém prostředí chitosan vysoce rozpustný a nabitý pro přeměnu svých aminových jednotek na NH3+ rozpustnou formu, interakce aminoskupin a protonovaných karboxylových skupin není dostatečně silná, aby podpořila bobtnání. Omezenému celkovému chování při bobtnání tak dominuje struktura alginátu vápenatého.
Obrázky 4 a 5 ukazují, že přípravky vykazují vysokou schopnost bobtnání při pH 6,8 a pH 7,4.
. U formulace CAl 600 hmotnost částic rychle roste, po 30 minutách dosahuje maxima a poté prudce klesá v důsledku eroze/rozpadu systému. Toto chování může být způsobeno iontově výměnnou reakcí mezi Na+ (přítomným ve fosfátovém pufru) a Ca2+ navázaným na karboxylové skupiny alginátu. Monovalentní ionty nahrazují dvojmocné ionty, což způsobuje rozpad „egg-box“ struktury a zvětšení vzdálenosti mezi polymerními řetězci a podporuje absorpci tekutiny a bobtnání systémů. Tento proces probíhá tak dlouho, dokud osmotický tlak do kuliček nevyváží pevnost příčných vazeb a fyzikálních propletenců, které zachovávají strukturu kuliček. Částice se tak začnou rozpadat a jejich hmotnost se zmenšuje.
Výsledky získané ze studie bobtnání dokazují, že kuličky CAlCh 600 a CAlCh 400 se vyznačují odolnější strukturou ve srovnání s CAl 600 a CAl 400, což lze pravděpodobně přičíst interakcím mezi alginátovými a chitosanovými řetězci. Maximální stupeň bobtnání chitosanových kuliček je nižší než u alginátu; systémy alginát-chitosan jsou schopny dosáhnout rovnovážného stavu bobtnání přibližně za 30 minut a udržet svou hmotnost na konstantní úrovni až do konce testu. Pravděpodobně interakce mezi oběma polymery jsou zodpovědné za vznik částic se značnou mechanickou odolností, která omezuje příjem tekutiny a rozpad struktury. Nakonec při porovnání chování při bobtnání kuliček CAl 400 versus CAl 600 a CAlCh 400 versus CAlCh 600 (stejné složení, různý průměr jehly použité při přípravě) lze konstatovat, že ve fosfátových pufrech CAl 400 a CAlCh 400 dosáhly maxima bobtnání vyššího než CAl 600, respektive CAlCh 600.
Profily uvolňování léčiva získané z různých formulací při pH 1,0, 6,8 a 7,4 jsou znázorněny na obrázcích 6-8. Uvolňování celekoxibu in vitro je ovlivněno pH zvolené tekutiny: procento léčiva uvolněného v kyselém prostředí za dvě hodiny je poměrně nízké a pohybuje se mezi 12,70 % a 24,53 % (obrázek 6). Zpoždění uvolňování celekoxibu lze přičíst snížené schopnosti bobtnání systémů v této tekutině; složení kuliček ani jejich průměr nemají na uvolňování léčiva vliv (hodnoty parametru f2 vždy nad 50). Při pH 1,0 se proces uvolňování řídí pouze difuzí léčiva. Tento výsledek umožňuje splnit první cíl této výzkumné práce, kterým je minimalizovat uvolňování léčiva v kyselém prostředí, aby se tento proces podpořil a zvýhodnil na střevní úrovni.
Ve fosfátovém pufru při pH 6,8 se formulace vyznačují chováním při uvolňování léčiva, které je ovlivněno jejich složením a není významně ovlivněno jejich rozměry (obrázek 7). V této tekutině systémy zpočátku bobtnají a poté erodují/disintegrují, a proto je proces uvolňování léčiva řízen nejprve difuzí a poté polymerní relaxací. Alginátové kuličky (CAl 600 a CAl 400) jsou schopny dokončit uvolňování celekoxibu přibližně za osm hodin; naopak po stejné době neprojde roztokem více než 75 % léčiva naloženého v alginát-chitosanových kuličkách. Srovnání výsledků z alginátových a alginát-chitosanových mikročásticových formulací ukazuje, že profily nejsou podobné a mají hodnoty f2 nižší než 50. Možným vysvětlením takového chování je elektrostatická interakce mezi karboxylovými skupinami alginátu a aminoskupinou chitosanu, která zlepšuje mechanickou odolnost polymerní sítě a snižuje její bobtnání a erozi při pH 6,8.
Překvapivě se rychlost uvolňování celekoxibu zpomaluje především u formulace CAlCh 400, i když se tato formulace vyznačuje nejmenší velikostí částic. Pravděpodobně malý průměr a velký povrch těchto částic vede k vytvoření silnější vrstvy chitosanu kolem kuliček, která klade velký odpor absorpci tekutiny a v důsledku toho i uvolňování léčiva.
Také při pH 7,4 lze rozdíly ve výkonech uvolňování léčiva přičíst spíše složení formulace než rozměrům částic (obr. 8). Všechny formulace vykazovaly téměř konstantní rychlost uvolňování léčiva. Neexistují rozdíly mezi křivkami uvolňování CAl 600 a CAl 400 a mezi křivkami uvolňování CAlCh 600 a CAlCh 400; pokud je v kuličkách chitosan, rychlost uvolňování léčiva klesá.
Stejné závěry ukazuje i analýza výsledků uvolňování léčiva prostřednictvím parametrů rozpouštění (t10%, t50% a t90%) (tabulka 3). Rozdíly v chování kuliček při uvolňování jsou zjištěny také prostřednictvím parametrů rozpouštění t10%, t50% a t90% a jsou dobře patrné pro dobu potřebnou k uvolnění 50 a 90% naloženého léčiva. Ve fosfátových pufrových roztocích potřebují alginát-chitosanové kuličky delší čas k uvolnění 50 a 90 % celekoxibu ve srovnání s alginátovými kuličkami. Přítomnost komplexu alginát-chitosan pravděpodobně vyvolává růst strukturních vrásek, nepravidelnost a složitost struktury kuliček, které ztěžují uvolňování léčiva.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Leave a Reply