ChIP aus dem alten Block: Jenseits der Chromatin-Immunpräzipitation

Eine Vielzahl von Techniken baut auf einer klassischen Methode – der Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) – auf, um festzustellen, was an die DNA bindet und wo. Neue Techniken verkleinern die Größe der Proben, untersuchen DNA-gebundene Proteinkomplexe oder bewerten die beteiligten Nukleotide genauer. Alle diese Ansätze zielen darauf ab, die seit langem bestehenden Beschränkungen der ChIP zu überwinden und die Fragen zu erweitern, die Wissenschaftler zur Genregulation, Entwicklung und Krankheit stellen können.

Die Chromatin-Immunpräzipitation, eine der am häufigsten verwendeten Techniken in der Molekularbiologie, wurde vor über 30 Jahren erfunden – und einige Dinge haben sich geändert, während andere gleich geblieben sind.

Das grundlegende Protokoll ähnelt immer noch einem in den 1980er Jahren entwickelten Protokoll, bei dem Proteine mit Formaldehyd an die DNA vernetzt werden und die DNA dann fragmentiert wird. Ein mit der DNA interagierendes Protein wird mit Hilfe eines Antikörpers immunpräzipitiert, die Vernetzungen werden mit Hitze rückgängig gemacht, und die assoziierte DNA wird analysiert. Später verknüpften die Forscher diese Technik mit der Tiefensequenzierung und entwickelten die ChIP-seq-Technik, um Protein-DNA-Interaktionen auf genomischer Ebene zu untersuchen.

ChIP wurde eingesetzt, um die Funktionsweise von Transkriptionsfaktoren, die Modulation der Genexpression durch Histone und andere grundlegende Fragen mit Auswirkungen auf die biologische Entwicklung und Krankheit zu untersuchen. Im September erhielten C. David Allis und Michael Grunstein den renommierten Lasker-Preis für ihre Arbeiten über Histone – Forschungen, die auf ChIP beruhen. Und ChIP-seq ist jetzt ein Eckpfeiler des ENCODE-Projekts (ENCyclopedia Of DNA Elements), das regulatorische Regionen des Genoms in verschiedenen Zelltypen kartieren soll.

Chromatinbiologinnen und -biologen entwickeln auch eine Reihe von Neben- oder Paralleltechnologien, die über das hinausgehen, was ChIP und ChIP-seq bieten, um Proteinkomplexe zu untersuchen, die genauen Nukleotide, an die ein Faktor bindet, genauer zu bestimmen, kleine Zellpools zu untersuchen und vorläufig damit zu beginnen, Protein-DNA-Interaktionen auf Einzelzellebene zu bewerten.

Alle diese Techniken zielen darauf ab, Dinge zu tun, die ChIP-seq allein nicht oder nur schleppend leisten kann. Und alle haben das gleiche grundlegende Ziel: herauszufinden, welche Moleküle mit der DNA verbunden sind und wo.

„Wir verstehen nicht wirklich die grundlegenden Prinzipien, nach denen die regulatorischen Funktionssequenzen in unserem Genom bestimmen, wo und wann Gene aktiviert werden“, sagt Bradley Bernstein, Direktor des Epigenomik-Programms des Broad Institute in Cambridge, Massachusetts. Er fügt hinzu, dass ChIP „in vielerlei Hinsicht begrenzt ist. Daher gibt es Bemühungen, neue Ansätze zu entwickeln oder die Technologie auf neue Art und Weise anzupassen.“

„Wir müssen präzise, deterministische Methoden entwickeln, um Einzelmolekül-Interaktionen systematisch in einzelnen Zellen direkt auszuwerten.“

Making it work

„Das als dunkle Kunst zu bezeichnen, ist zu viel“, sagt Nir Friedman, Professor für Informatik und Biologie an der Hebräischen Universität Jerusalem, Israel. Aber obwohl es sich um eine weit verbreitete Technik handelt, „haben nur sehr wenige Menschen die Geduld, ihre Experimente zu kalibrieren“, sagt er.

ChIP-seq-Experimente erzeugen eine Menge Rauschen, bemerkt Friedman. Formaldehyd kann unbeteiligte Moleküle vernetzen, Antikörper können Nicht-Zielproteine herunterziehen, und die Beschallung – die gängigste Methode zum Aufbrechen von DNA – neigt dazu, DNA aufzubrechen, die sich in einer offenen Konformation befindet. Friedman: „Es kann sein, dass mehr als die Hälfte dessen, was man am Ende sequenziert oder betrachtet, unspezifische Bindungen sind.“

ENCODE veröffentlicht Richtlinien zur Bewertung der Qualität von Antikörpern und zum Aussortieren bedeutungsloser Daten, so Friedman. Das Projekt bietet auch Zugang zu neueren Berechnungswerkzeugen, die beispielsweise zur Normalisierung von Daten auf Kontrollen und zur Identifizierung von „Peaks“ oder Regionen mit möglicher DNA-Bindung verwendet werden.

Die Auswahl des richtigen Antikörpers kann eine Herausforderung sein, bemerkt Michael-Christopher Keogh, Chief Scientific Officer bei EpiCypher, einem Epigenomik-Unternehmen in Research Triangle Park, Durham, North Carolina. Keogh war an einer kürzlich durchgeführten Studie beteiligt, die zeigte, dass viele für die Histonforschung gängige Antikörper bei ChIP schlecht abschneiden, weil sie beispielsweise an Epitope außerhalb des Ziels binden. In der Studie werden auch Validierungsschritte vorgeschlagen, die über die ENCODE-Leitlinien hinausgehen.

Einige Forscher umgehen das Antikörperproblem, indem sie ihr Ziel mit einem Epitop-Tag versehen, wie bei CETCh-seq (CRISPR epitope tagging ChIP-seq). Eine seit langem angewandte Technik, DamID (DNA-Adenin-Methyltransferase-Identifizierung), beinhaltet die Entwicklung von Faktoren, die benachbarte DNA mit molekularen Markierungen versehen.

Andere Forscher sind noch dabei, die grundlegende ChIP-Technik zu verbessern, wie z. B. die Gruppe von Alon Goren an der medizinischen Fakultät der Universität von Kalifornien in San Diego, die ChIP-seq vollständig automatisiert hat. Goren sagt, dass die optimale Antikörperkonzentration je nach Antikörper und Zelltyp stark variieren kann und dass einige Schritte, wie z. B. die Rückwärtsvernetzung, unnötig sind. Das Goren-Labor hat auch gezeigt, dass monoklonale Antikörper gegenüber polyklonalen Antikörpern im Vorteil sind.

Aber selbst bei vollständiger Optimierung sind der ChIP-seq-Methode noch grundlegende Grenzen gesetzt. So sind in der Regel 100.000 oder mehr Zellen erforderlich, um Transkriptionsfaktoren zu bestimmen, und 10.000 oder mehr, um Histonproteine zu bestimmen, sagt Goren. Und in den meisten Fällen ist die Methode darauf ausgerichtet, ein Protein und einen Antikörper nach dem anderen zu untersuchen.

Sagt Goren: „Sobald wir in der Lage sind, den Blick von der Betrachtung von Proteinen auf die Betrachtung von Komplexen zu verlagern, werden wir ein viel besseres Verständnis dafür bekommen, wie die Biologie funktioniert und was bei Krankheiten passiert.“

Proteinkomplexe in den Griff bekommen

Ein Ansatz zur Untersuchung von Komplexen ist die Kombination von ChIP-seq mit Massenspektrometrie (MS), wobei Methoden wie RIME (Rapid Immunoprecipitation Mass spectrometry of Endogenous proteins) und ChIP-MS eingesetzt werden.

Ein Nachteil dieser Methoden ist jedoch, dass auch Proteine, die nicht mit der DNA assoziiert sind, durch Immunpräzipitation herausgezogen werden können, sagt David Steger, Molekularbiologe an der Universität von Pennsylvania in Philadelphia. Stattdessen, so Steger, „versucht jeder, eine ortsspezifische Proteomik an einem bestimmten Enhancer zu entwickeln.“

Eine neue Technik zur Bewertung chromatingebundener Komplexe ist ChIP-SICAP (selective isolation of chromatin-associated proteins), die von Jeroen Krijgsvelds Team am Deutschen Krebsforschungszentrum in Heidelberg und seinen Kollegen entwickelt wurde. Bei dieser Technik wird Antikörper-gebundene DNA mit Biotin markiert, die dann mit Biotin-bindenden Streptavidin-Perlen vor der Massenspeicherung heruntergezogen wird.

Steger wendet ChIP-SICAP an, um Proteine zu untersuchen, die an Enhancer gebunden sind, die den Übergang von mesenchymalen Stammzellen zu Adipozyten steuern. Steger sagt: „Wir versuchen, ein Enhancer-Proteom zu identifizieren.“

Andere Ansätze nutzen das Gen-Editing-System Cas9, das Leit-RNAs erkennt, die auf bestimmte DNA-Sequenzen ausgerichtet sind. Die Forscher haben Cas9 mit Biotin oder einem Enzym markiert, das die Biotin-Markierung von Proteinen in der Nähe fördert, die dann mittels MS analysiert werden. Dieser Ansatz wurde auch eingesetzt, um Wechselwirkungen zwischen weit entfernten genomischen Elementen aufzudecken. Solche Methoden könnten möglicherweise das Repertoire der ChIP-seq-verwandten Methoden erweitern, die die 3D-Architektur des Genoms bewerten können, wie Hi-C, ChIA-PET (Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag sequencing) und HiChIP, sowie neuere Methoden wie SPRITE (Split-Pool Recognition of Interactions by Tag Extension).

Diese neuen Methoden zur Bewertung von DNA-gebundenen Komplexen versprechen, den Blick der Biologen auf die Genregulation zu schärfen. Wenn sie jedoch mit MS eingesetzt werden, müssen sie die Einschränkung hinnehmen, dass MS nicht ohne weiteres Proteine mit geringer Häufigkeit nachweisen kann, merkt Steger an. Außerdem sind nicht alle neueren Techniken auch für Laien zugänglich.

Einige Unternehmen bieten Dienstleistungen für das Outsourcing etablierterer Techniken wie RIME oder ChIP-seq an. Zu den Unternehmen, die ChiP-seq und verwandte Dienstleistungen anbieten, gehören Active Motif in Carlsbad (Kalifornien), Diagenode in Lüttich (Belgien) und Denville (New Jersey) sowie Novogene in Peking. Diese und andere Unternehmen bieten auch ChIP-seq-Kits und -Komponenten an, obwohl viele Labors ihre eigenen Reagenzien herstellen. Keogh weist auch darauf hin, dass interne Forschung eine bessere Kontrolle über die Optimierungsschritte bedeuten kann.

Die Sorgfalt bei den experimentellen Parametern während der ChIP-Experimente kann selbst die Qualität der Daten erhöhen, sagt Cigall Kadoch, dessen Gruppe mehrere große makromolekulare Proteinkomplexe am Dana-Farber Cancer Institute und der Harvard Medical School in Boston, Massachusetts, untersucht.

Kadoch achtet darauf, die Formaldehydkonzentration, die zur Vernetzung der Proteine untereinander und mit der DNA verwendet wird, für jeden Antikörper und jeden Zelltyp zu optimieren. Bei der Auswahl der Antikörper achtet sie darauf, ob das Epitop voraussichtlich auf der Oberfläche zugänglich ist und sich daher für eine Immunpräzipitation eignet. Um den DNA-Fußabdruck eines vollständig aufgebauten Komplexes zu sehen, rät sie, einen Antikörper gegen ein Protein zu wählen, das erst spät im Aufbauprozess hinzugefügt wird. „Das sind die Dinge, die über Erfolg oder Misserfolg eines Projekts entscheiden“, sagt Kadoch.

Faktorbindung aufspüren

Eine weitere von Steger verwendete Technik ist ChIP-exo (ChIP-Exonuklease). Er setzt sie ein, um in Basenpaar-Auflösung zu ermitteln, wo verschiedene Faktoren im Genom binden.

Diese Technik beginnt mit der Fragmentierung der DNA durch Beschallung. Eine Exonuklease zerkleinert die DNA (in 5′-3′-Richtung) bis zu dem Punkt, an dem die DNA durch Formaldehyd mit dem gebundenen Protein verbunden ist. Dieser Ansatz führt zu einem scharfen DNA-„Fußabdruck“ für gebundene Faktoren, der genauer sein kann als die durch ChIP-seq rechnerisch ermittelten Motive.

„Wir beginnen immer mit ChIP-seq, und wenn sich unsere Fragen weiterentwickeln, gehen wir zu ChIP-exo über“, sagt Steger, der diese Technik zur Untersuchung der Bindung des Glucocorticoid-Rezeptors an die DNA eingesetzt hat. Der Rezeptor bindet als Dimer an zwei aneinander grenzende, kurze DNA-Sequenzen. Steger konnte die Bindung eines Monomers auflösen, was ihm mit ChIP-seq nicht möglich war.

Das Team von Frank Pugh, Professor für Biochemie und Molekularbiologie an der Penn State University in University Park, Pennsylvania, hat kürzlich seine ChIP-exo-Methode vereinfacht und an die häufig verwendete Illumina-Sequenzierungsplattform angepasst. In ähnlicher Weise haben Julia Zeitlinger, Associate Investigator am Stowers Institute for Medical Research in Kansas City, Missouri, und ihre Kollegen eine ähnliche Technik, ChIP-nexus, veröffentlicht. Beide Entwicklungen sind „vielversprechend“, sagt Michael Snyder, Inhaber des Lehrstuhls für Genetik und Direktor des Stanford Center for Genomics and Personalized Medicine an der Stanford University in Kalifornien.

Kleiner und tiefer

Forscher konnten die Anzahl der für ChIP-seq benötigten Zellen verringern, indem sie die experimentellen Parameter anpassten, z. B. durch die Verwendung eines hochwertigen Antikörpers, sagt Friedman.

Einige Techniken, darunter eine von Friedman entwickelte, verwenden barcodierte Sequenzierungsadapter, die eine geringere Probengröße ermöglichen. Und eine neue Technik namens „ChIPmentation“ reduziert die Schritte, die zur Herstellung von Sequenzierungsbibliotheken erforderlich sind.

Eine Methode, die in neuen Labors Einzug hält, ist CUT&RUN (Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease), entwickelt von Steve Henikoff und seinen Kollegen am Fred Hutchinson Cancer Research Center in Seattle, Washington. Bei dieser Methode wird auf die Quervernetzung durch Formaldehyd sowie das Abscheren der DNA durch Beschallung verzichtet. Stattdessen wird ein Antikörper gegen das Ziel an eine mikrokokkale Nuklease (MNase) gebunden, die durch Kalzium aktiviert wird, um die DNA auf beiden Seiten des Ziels zu spalten. Die resultierenden DNA-Fragmente werden sequenziert.

„Man erhält eine große Signal-Rausch-Reduzierung“ im Vergleich zu ChIP-seq, sagt John Stamatoyannopoulos, Direktor des Altius Institute for Biomedical Sciences in Seattle. Das liegt zum Teil an dem sauberen Schnitt der DNA durch die Nuklease, bei dem nur wenige Schnitte außerhalb des Geländes entstehen. Infolgedessen erfordert CUT&RUN in der Regel weniger DNA-Sequenzierungslesevorgänge als ChIPseq – was die Kosten senkt – und kann bei einer viel geringeren Anzahl von Zellen angewendet werden. Henikoffs Team wendete die Technik kürzlich auf 1.000 Zellen für einen Transkriptionsfaktor und 100 Zellen für eine Histonmodifikation an. Laut Stamatoyannopoulos hat die Methode die ChIP-seq-Methode in seinen Labors weitgehend verdrängt.

CUT&RUN hat auch Vorteile, die über geringe Zellzahlen hinausgehen. Stuart Orkin, Molekularbiologe und Professor an der Harvard University, lobt die Technik für ihre „im Wesentlichen nukleotidgenaue“ Auflösung. Mit geringfügigen Änderungen an den Berechnungswerkzeugen war seine Gruppe in der Lage, die eng beieinander liegenden Bindungsstellen eines Transkriptionsfaktors zu differenzieren, der an der Kontrolle der Expression von fötalem Hämoglobin beteiligt ist. Vor diesem Ergebnis war es ihm nicht möglich, den Transkriptionsfaktor mit konventionellem ChIP zu immunopräzipitieren, möglicherweise weil die Epitope durch die Formaldehyd-Vernetzung verdeckt wurden. CUT&RUN „funktionierte auf Anhieb“, sagt er.

Henikoffs Labor hat die Technik angepasst, um weitreichende 3D-DNA-Wechselwirkungen zu bewerten und um eine Immunpräzipitation der abgespaltenen Fragmente mit einem zweiten Antikörper durchzuführen. Die Gruppe untersuchte zwei molekulare Merkmale desselben Proteinkomplexes – ein Ansatz, der zur Klärung von Fragen beitragen könnte, z. B. welche Kombinationen von Histonmarkierungen mit verschiedenen Genzuständen verbunden sind.

Arbeiten auf Einzelzellebene

Für viele Molekularbiologen, darunter auch Chromatinforscher, ist die Einzelzelle die letzte Grenze.

„Wir müssen präzise, deterministische Methoden entwickeln, um Einzelmolekül-Interaktionen systematisch in Einzelzellen direkt zu bewerten“, sagt Bernstein. „Das ist ein langfristiges Ziel.“ Einzelzelldaten könnten möglicherweise DNA-bindende Faktoren verfolgen, wenn Zellen während der Entwicklung den Stammzellstatus verlassen, oder in Tumoren mit einem hohen Maß an zellulärer Heterogenität.

Es gibt verschiedene Ansätze, die diesem Ziel näher kommen. Allerdings haben viele der Einzelzellmethoden eine begrenzte Empfindlichkeit“, sagt Christopher Benner, Genombiologe an der University of California, San Diego. Bernstein und seine Kollegen haben beispielsweise mit Hilfe eines mikrofluidischen Systems und Barcoding Einzelzell-ChIPseq-Daten erzeugt. Von jeder Zelle erfasste die Technik zwischen 500 und 10.000 einzigartige „Reads“, die ein DNA-Bindungsereignis darstellen, im Gegensatz zu den Millionen von Reads, die mit Zellpopulationen erfasst werden.

Mit verschiedenen Methoden können auch Daten über die aktiven Regionen des Genoms gewonnen werden. Bei ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing) wird eine hyperaktive Transposase eingesetzt, die sich in offenen Chromatinregionen in das Genom integriert und Sequenzierungsadapter einführt. ATAC-seq kann an einzelne Zellen angepasst werden, und die resultierenden Sequenzdaten können mit einer Vielzahl von Berechnungsansätzen abgefragt werden. Mit diesen Ansätzen können zum Beispiel Promotorsequenzen identifiziert werden – oder Muster in Experimenten, bei denen gleichzeitig DNA-Kontrollelemente ausgeschaltet oder die RNA-Expression bewertet wird.

ATAC-seq hat Nachteile, wie die unvollständige Integration in zugängliche Regionen, bemerkt Snyder. Aber die Technik kann sehr leistungsfähig sein: Sie kann eingesetzt werden, um Fluorophore einzufügen und abzubilden, was zu bildgebenden Daten über die 3D-Organisation des Genoms vor der Sequenzierung führt, bemerkt Snyder.

Snyder verweist auf Bildgebungsarbeiten in Labors wie dem von Alistair Boettiger in Stanford, der Möglichkeiten zur gleichzeitigen Abbildung genetischer Elemente und entstehender RNA-Transkripte mit superauflösender Bildgebung entwickelt, um zu beurteilen, welche Elemente die Genexpression fördern oder unterdrücken. „Die Bildgebung ist die Zukunft“, fügt Stamatoyannopoulos hinzu. Andere Forscher weisen darauf hin, dass mit der Verbesserung der Nanoporen-Sequenzierung der „dritten Generation“ auch ChIP-ähnliche Methoden entwickelt werden, die sich mit ihr verbinden lassen.

„Wir brauchen vielleicht völlig orthogonale Methoden“, sagt Bernstein über die Einzelzell-Chromatinanalyse. Dieses Ziel wird wahrscheinlich am Ende erfolgreich erreicht werden, sagt er, mit „Technologien, die eine radikale Abkehr von dem sind, was wir jetzt verwenden.“

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