Chemische Derivatisierung in der Bioanalytik

Anwendungen

Die chemische Derivatisierung hat sich seit langem als analytische Technik in der Bioanalytik bewährt, um Probleme zu überwinden, die mit geringer Ionisierungseffizienz, Instabilität der Verbindungen, schlechter Selektivität oder inakzeptabler chromatographischer Leistung (schlechte Retention, schlechte Peakform und Verschleppungsprobleme) und sogar geringer Flüchtigkeit bei der GC-Trennung verbunden sind. Diese Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug in vielen Bereichen der Chemie, einschließlich der Medizin, der Forensik, der Lebensmittelwissenschaft, der Dopingkontrolle und der Umweltdisziplinen. Ziel der chemischen Derivatisierung ist es, die Struktur des Analyten (entweder ein Nukleophil oder ein Elektrophil) mit Hilfe eines chemischen Reagens (entweder ein Elektrophil oder ein Nukleophil, je nach Art des Analyten) zu verändern, wodurch eine neue Verbindung (das Derivat der Reaktion) mit verbesserten chemischen und physikalischen Eigenschaften für die Analyse gebildet wird. Die Reaktionsbedingungen (Menge des Reagenzes, Reaktionszeit und -temperatur usw.) werden so optimiert, dass das gewünschte Derivat mit der höchstmöglichen Reaktionsausbeute gebildet wird. Zusätzliche Probenreinigungsverfahren können entwickelt werden, um unerwünschte Nebenprodukte und überschüssige Reagenzien zu beseitigen und so die Rückschlüsse auf den Analyten bei der Analyse zu minimieren.

Durch die chemische Derivatisierung wird die Analyse des Unmöglichen möglich. In der Literatur sind viele Beispiele dafür beschrieben worden, die sich auf die GC-, LC-MS/MS- und NMR-Detektion auswirken. Am bemerkenswertesten ist die chromatographische Trennung von Enantiomeren durch chirale Derivatisierung unter Verwendung spezifischer Auflösungsreagenzien ohne Verwendung spezieller chiraler Säulen und Trennbedingungen.

Überlegungen

Die Auswahl des geeigneten chemischen Reagenzes ist für eine erfolgreiche Derivatisierung unerlässlich und hängt von der jeweiligen Anwendung ab. Im Allgemeinen wird, wenn der Zielanalyt ein Nukleophil (Verbindung mit einem Elektronenüberschuss) ist, ein Elektrophil (Verbindungen mit einem allgemeinen Elektronenmangel) als Reagenz gewählt und umgekehrt. Die Reagenzien müssen selektiv sein (auf eine bestimmte Stelle des Moleküls abzielen), wodurch eine Derivatisierung an mehreren Stellen des Zielmoleküls, der Metaboliten oder der endogenen Komponenten vermieden wird. Beispielsweise sollte bei einem Molekül, das sowohl funktionelle Hydroxyl- als auch Aminogruppen enthält, die Verwendung von Säurechloriden oder Anhydriden als Derivatisierungsreagenzien vermieden werden, da diese beide funktionellen Gruppen derivatisieren. Die Verwendung von Dansylchlorid als Derivatisierungsreagenz ist dagegen für funktionelle Amino- und Phenolgruppen geeignet, da es nicht mit aliphatischen Alkoholen reagiert. Weitere Voraussetzungen, die bei der Auswahl des Reagens zu berücksichtigen sind, sind Verfügbarkeit (im Handel), Reinheit und Kosten. In der Regel sind die Kosten für die Reagenzien minimal und stellen daher kein Hindernis für die Anwendung dar.

Unter optimierten Bedingungen sind chemische Derivatisierungsverfahren in der Regel robust genug, um für die pharmazeutische Bioanalyse eingesetzt zu werden, und sie können die Erwartungen der Behörden erfüllen. Dies wird in der Regel im Rahmen eines strengen Validierungsprozesses nachgewiesen, bei dem verschiedene Parameter wie z. B. Genauigkeit, Präzision, Selektivität, Matrixeffekt usw. geprüft werden. Die Auswahl des internen Standards ist von entscheidender Bedeutung, um einen möglichen Verlust des Analyten während der verschiedenen Schritte der Probenbehandlung und Bioanalyse zu korrigieren und so die Robustheit des Tests zu gewährleisten. Wenn möglich, sollte ein deuterium- oder 13C-stabiler interner Standard verwendet werden, andernfalls kann ein Analogon mit ähnlicher Reaktivität, Wiederfindung und chromatographischen Eigenschaften verwendet werden. Außerdem ist es unerlässlich, die Stoffwechselwege des interessierenden Analyten zu berücksichtigen und zu bewerten; die Rückumwandlung von Metaboliten in das Ausgangsmolekül muss während des Derivatisierungsverfahrens vermieden werden, da diese Prozesse oft unter harten Bedingungen ablaufen (pH-Wert, Hitze, lange Inkubationszeiten usw.). Leider kann dies durch das Fehlen von Referenzstandards für die Metaboliten und das Fehlen von Stoffwechselinformationen zu einem frühen Zeitpunkt im Lebenszyklus der Arzneimittelentwicklung aufgrund von differenzierten oder beschleunigten Entwicklungsstrategien erschwert werden.

Chemische Derivatisierung als Kunstform

Die Verwendung der chemischen Derivatisierung ist in den letzten Jahren zurückgegangen, da sich neue Trenntechnologien entwickelt haben und alltäglicher geworden sind. Die Entwicklung der überkritischen Flüssigkeitschromatographie (SFC) zum Beispiel hat einen neuen Weg für die chirale Stereoisomeranalyse eröffnet, wodurch die Notwendigkeit der chiralen Derivatisierung in bestimmten Fällen verringert wurde. Empfindlichere Generationen von Triple-Quadrupol-Massenspektrometern mit neuen oder verbesserten Ionisierungstechnologien verschieben die Nachweisgrenzen in den niedrigen Pikogramm-Bereich, so dass der Bedarf an chemischer Derivatisierung zur Verbesserung der Assay-Empfindlichkeit (durch verbesserte Ionisierung oder Selektivität) zurückgegangen ist. Andere Technologien wie UHPLC, Mikro-/Nano-LC (für eine bessere Ionisierungseffizienz) und TOF-Geräte mit Ionenmobilität (elektronische Trennung statt chemischer/physikalischer Trennung) haben ebenfalls zum Rückgang der chemischen Derivatisierung im bioanalytischen Labor beigetragen. Dennoch wird diese Technik nach wie vor für sehr komplexe Trennungen eingesetzt, bei denen die vorgenannten Technologien keine ausreichende Wirkung erzielen können. Manchmal hat die Kopplung der chemischen Derivatisierung mit einer dieser Technologien eine verstärkte/additive Wirkung. Insbesondere die Kombination von SFC mit chiraler Derivatisierung hat sich bei der chiralen Trennung im Vergleich zur SFC-Analyse als überlegen erwiesen (Daten nicht gezeigt).

Aufgrund dieses Rückgangs der Technik und ihrer Komplexität im Vergleich zu anderen Analysetechniken hat sich die chemische Derivatisierung zu einer besonderen „Kunstform“ im Labor entwickelt, die spezielle Fähigkeiten in Verbindung mit einem hohen Maß an Chemiekenntnissen erfordert. Infolgedessen gelingt es immer weniger Wissenschaftlern in DMPK-Umgebungen, diese Technik zu beherrschen und ihre Anwendung zu erlernen. Es stellt sich daher die Frage, wie diese Fähigkeiten erhalten und an künftige Generationen von analytischen Wissenschaftlern weitergegeben werden können. Sonderhefte wie dieses, Übersichtsartikel, Buchkapitel und Anleitungen mit Versuchsprotokollen werden hoffentlich den Einsatz der chemischen Derivatisierung als großartiges analytisches Werkzeug erleichtern und fördern.

Übersicht

Dieses Themenheft behandelt Fortschritte bei bestehenden Derivatisierungstechniken, die in der bioanalytischen Forschung eingesetzt werden, sowie innovative neue Methoden und Ansätze (z. B., Kombination von Derivatisierung mit Mikrofluss-LC-MS und die Idee neuer chemischer Markierungstechniken von Niwa et al.).

Die Ausgabe zielt darauf ab, Aspekte zu behandeln, die mit:

• Derivatisierungsmethoden in der LC-MS-Bioanalyse (einschließlich HPLC);

• Peptidderivatisierung für die Analyse von Proteintherapeutika;

• Chirale Derivatisierungsreagenzien für biologische Proben (siehe Vashistha et al. );

• Derivatisierung zur Analyse endogener Verbindungen (siehe „Beyond Classical Derivatization: Analyte ‚derivatives‘ in the bioanalysis of endogenous and exogenous compounds“ von Barnaby et al. oder „Derivatization of steroids in biological samples for GC-MS and LC-MS analyses“ von Marcos et al.);

• Derivatisierungsverfahren in der Dopingkontrolle beim Menschen (siehe den interessanten Überblick von Athanasiadou et al. ).

Es stimmt zwar, dass die chemische Derivatisierung nur ein weiteres Werkzeug in der bioanalytischen Werkzeugkiste ist, aber sie ist ein „Muss“ für ein DMPK-Labor und wird auch in Zukunft einen Einfluss auf viele bioanalytische Herausforderungen haben.

Wenn Sie also Ihren Analyten nicht mögen, ändern Sie ihn (mit chemischer Derivatisierung, versteht sich)!