Caco-2-Permeabilitätstest

Fragen und Antworten zur Caco-2-Permeabilität

Bitte geben Sie einen Überblick über den Caco-2-Permeabilitätstest von Cyprotex.

Caco-2-Zellen werden häufig als In-vitro-Modell für die Vorhersage der Absorption von Arzneimitteln beim Menschen verwendet. Die Caco-2-Zelllinie stammt von einem menschlichen Kolorektalkarzinom ab, und wenn sie kultiviert wird, differenzieren sich die Zellen spontan in Monolayer aus polarisierten Enterozyten.

Die Zellen werden auf Multiwell-Insert-Platten ausgesät und bilden 20 Tage vor dem Experiment einen konfluenten Monolayer. Am 20. Tag wird die Prüfsubstanz auf die apikale Seite der Membran gegeben, und der Fluss der Substanz durch die Monoschicht wird über einen Zeitraum von 2 Stunden überwacht.

Der Permeabilitätskoeffizient (Papp) wird anhand der folgenden Gleichung berechnet:

wobei dQ/dt die Permeationsrate des Wirkstoffs durch die Zellen, C0 die Donorkonzentration zum Zeitpunkt Null und A die Fläche der Zellmonoschicht ist.

Wie interpretiere ich die Daten aus dem Caco-2-Permeabilitätstest?

Es gibt mehrere Möglichkeiten, wie die Daten aus dem Caco-2-Permeabilitätstest verwendet werden können. Erstens können die Verbindungen nach ihren Papp-Werten geordnet werden. Zwei Referenzsubstanzen, Atenolol (passiver parazellulärer Transport) und Propranolol (passiver transzellulärer Transport), werden neben den Prüfsubstanzen untersucht. Atenolol und Propranolol werden bekanntermaßen zu 50 % bzw. 90 % vom Menschen aufgenommen2,3 und können als Marker für die Einstufung der Prüfsubstanzen verwendet werden. Zweitens können die Daten in Verbindung mit anderen In-vitro-Parametern verwendet werden, um die orale Pharmakokinetik einer Substanz in vivo mit Hilfe der Simulationssoftware Cloe PK vorherzusagen. Drittens können die Caco-2-Daten zur Vorhersage der Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke (BBB) verwendet werden (Abbildung 3).

Abbildung 3
Korrelation zwischen dem von Caco-2 abgeleiteten Pactive ((PappB-A – PappA-B)/2) und der in situ BBB-Permeationsrate, logPS (Permeabilitäts-Oberflächen-Produkt). Medikamente, von denen bekannt ist, dass sie die BHS durchdringen (Koffein, Imipramin, Progesteron), haben einen logPS-Wert >-2,0 (grün schattierte Fläche), während Medikamente, von denen bekannt ist, dass sie die BHS nicht durchdringen (Aldosteron, Hydrocortison, Cimetidin), einen logPS-Wert ≤-3,5 haben (rosa schattierte Fläche).

Eine Regressionslinie ist dargestellt, die eine klare Korrelation zwischen Pactive und logPS für Verbindungen zeigt, die in den Caco-2-Zellen keine signifikante Effluxaktivität aufweisen, d.h., für Verbindungen mit einer Pactive von < 5 × 10 -6 cm/s. Anhand dieser Korrelation kann der Caco-2-Assay von Cyprotex zur Bewertung des BHS-Potenzials von Verbindungen mit einer Pactive < 5 × 10 -6 cm/s verwendet werden.

Wie ist die Beziehung zwischen der Caco-2-Permeabilität und der Absorption im menschlichen Darm?

Die Beziehung zwischen der Caco-2-Permeabilität (unter Verwendung von HBSS-Puffern mit pH 7,4 sowohl im apikalen als auch im basolateralen Kompartiment) und der Absorption im menschlichen Darm ist in Abbildung 4 dargestellt. Diese Korrelation ist typisch für die in der Literatur beobachteten Zusammenhänge zwischen diesen beiden Parametern4. Es ist wichtig zu beachten, dass diese Darstellung von der Genauigkeit der Darmabsorptionsdaten beeinflusst wird. Die in diesem Diagramm verwendeten Darmabsorptionswerte stammen von Zhao et al. 20012. In dieser Arbeit wurde die Absorption im menschlichen Darm aus verschiedenen Quellen entnommen und variiert erheblich in der Qualität. Von mehreren Verbindungen ist auch bekannt, dass sie eine dosisabhängige Absorption aufweisen (dargestellt durch Fehlerbalken im Diagramm).

Abbildung 4
Beziehung zwischen Caco-2-Permeabilität und % Absorption im menschlichen Darm.

Was sind die Unterschiede zwischen dem PAMPA- und dem Caco-2-Permeabilitätstest?

Der Caco-2-Permeabilitätstest gilt als repräsentativer für die menschliche Absorption in vivo als der PAMPA-Test (paralleler künstlicher Membranpermeabilitätstest). PAMPA liefert lediglich ein Maß für die passive Diffusion, während das Caco-2-Modell eine bessere Vorhersage der menschlichen Absorption für Verbindungen ermöglicht, die eine aktive Aufnahme oder einen aktiven Ausfluss aufweisen oder die Membran über den parazellulären Weg passieren. Die Informationen aus beiden Assays, die zusammen verwendet werden, können wertvoll sein, um die Ursache für eine schlechte Absorption zu ermitteln.

Wie messe ich den Wirkstoff-Efflux?

Ein bidirektionaler Caco-2-Permeabilitätstest wird durchgeführt, bei dem der Transport der Substanz sowohl in apikaler zu basolateraler Richtung als auch in basolateraler zu apikaler Richtung gemessen wird. Das Ergebnis wird normalerweise als Efflux-Verhältnis angegeben, d. h. Papp(B-A)/Papp(A-B). Wenn das Efflux-Verhältnis größer als zwei ist, deutet dies auf einen Wirkstoff-Efflux hin. Talinolol, ein bekanntes P-gp-Substrat, wird als Kontrollsubstanz untersucht, um zu bestätigen, dass die Zellen funktionelle Efflux-Transporterproteine exprimieren.

Woher wissen Sie, ob die Zellen eine konfluente Monoschicht gebildet haben?

Die Messung des elektrischen Transsepithelwiderstands (TEER) wird verwendet, um die Bildung von tight-junction zwischen den Zellen festzustellen. Außerdem wird Luzifergelb, ein Marker für die Membranintegrität, zu Beginn des Experiments mit der Testverbindung ko-inkubiert. Wenn der Papp-Wert von Luzifergelb in einer Vertiefung 1,0 × 10 -6 cm/s übersteigt, das abgeleitete Papp-Ergebnis für die Prüf- oder Kontrollsubstanz in dieser Vertiefung jedoch qualitativ mit dem in den verbleibenden Replikationsvertiefungen ermittelten Ergebnis übereinstimmt (innerhalb des Schwellenwerts für Luzifergelb), kann die Zellmonolage nach dem wissenschaftlichen Urteil des verantwortlichen Wissenschaftlers als akzeptabel angesehen werden. Ist dies nicht der Fall, so wird das Ergebnis der betroffenen Monoschicht ausgeschlossen und ein n=1-Ergebnis gemeldet, oder die Verbindung kann erneut getestet werden. Sind beide Replikate betroffen, wird die Verbindung erneut getestet. Wenn beide Luzifergelb-Papp-Werte für dieselbe Verbindung bei zwei verschiedenen Gelegenheiten ausfallen, wird davon ausgegangen, dass die Verbindung entweder zytotoxische Wirkungen gegen die Caco-2-Zellen oder eine inhärente Fluoreszenz aufweist.

Wie und warum wird die prozentuale Wiederfindung berechnet?

Die prozentuale Wiederfindung kann bei der Interpretation der Caco-2-Daten hilfreich sein. Ist die Wiederfindung sehr niedrig, kann dies auf Probleme mit der schlechten Löslichkeit, der Bindung der Verbindung an die Platte, dem Stoffwechsel der Caco-2-Zellen oder der Akkumulation der Verbindung in der Zellschicht hinweisen.